PROCESO DE INGENIERÍA CROMOSÓMICA MEDIANTE EL USO DE UN NUEVO SISTEMA DE REPARACIÓN DEL ADN.

Proceso de Ingeniería Cromosómica Mediante el Uso de un Nuevo Sistema de Reparación del ADN CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a un proceso de ingeniería cromosómica y a su uso, especialmente para la producción de grandes repertorios de mosaicos genómicos inter-especie que codifican una amplia diversidad de rutas metabólicas. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN ES 2 367 661 T3 Cientos de fragmentos cromosómicos parcialmente solapantes se podrían volver a unir posiblemente por medio de mecanismos que implican una síntesis de ADN no significativa, p.ej., mediante (i) la unión de extremos no homólogos (NHEJ) de fragmentos de ADN 1,2 registrados por alguna forma especial de cromatina 3 o (ii) la recombinación homóloga (HR) por medio de entrecruzamientos conservativos que implican los extremos de fragmentos solapantes 4-6 . Debido al gran número de fragmentos de ADN, la síntesis reparativa de ADN significativa puede estar implicada en la (iii) hibridación monocatenaria (SSA) que requiere una erosión exonucleolítica sesgada de las cadenas de los extremos de los fragmentos de ADN, lo que libera las cadenas complementarias para la hibridación con las protrusiones monocatenarias complementarias de otros fragmentos 4 . De manera alternativa, el ensamblaje de fragmentos podría requerir o implicar una síntesis de ADN masiva, p.ej., (iv) mediante invasión de cadenas entre fragmentos solapantes (formación de bucles D) que ceban la prolongación de los extremos 3' emparejados (p.ej., moviendo un bucle D, como en la transcripción, Fig. 4) hasta el extremo del fragmento que actúa como molde, seguido por la hibridación de los extremos así prolongados por medio de colas monocatenarias complementarias (el denominado mecanismo de hibridación de cadenas dependiente de la síntesis o SDSA 7 ), o (v) mediante cualquier tipo de mecanismos de replicación del ADN de "elección de copia" (CC) que alterna y copia moldes bicatenarios de un fragmento a otro hasta que se sintetiza de nuevo un cromosoma de tamaño completo 8 . Un objetivo de la presente invención es formar especies híbridas nuevas o cromosomas nuevos mediante recombinaciones intergenéricas y/o interespecíficas in vivo, de una manera que sea eficaz y fácil de llevar a la práctica. Otro objetivo de esta invención es usar la ingeniería cromosómica in vivo, p.ej. en una bacteria extremófila Deinococcus D. radiodurans, o en cualquier otro organismo resistente a la radiación y/o a la desecación y/o al tratamiento químico que posea mecanismos de reparación del ADN similares (en la presente memoria descritos como ESDSA) para ensamblar su ADN fragmentado hasta cromosomas funcionales intactos. Aún otro objetivo de esta invención es usar la ingeniería cromosómica in vitro, p.ej. en extractos exentos de células de D. radiodurans, o en extractos exentos de células activas de cualquier otro organismo resistente a la radiación y/o a la desecación que poseen mecanismos de reparación del ADN similares (en la presente memoria descritos como ESDSA) para ensamblar su ADN fragmentado en cromosomas funcionales intactos. Otro objetivo de esta invención es usar la estrategia anteriormente mencionada para proporcionar sitios de integración de ADN exógeno añadiendo adiciones terminales monocatenarias o bicatenarias idénticas, o similares, a cualquier secuencia cromosómica como sitios para su integración durante el proceso de la reparación del ADN in vivo o in vitro. Otro objetivo de esta invención es usar ADN intacto o fragmentado de cualquier especie biológica, o incluso ADN creado mediante síntesis artificial, como elementos genéticos para ser integrados en el cromosoma bacteriano y para convertirse en una parte integral del mismo. Aún otro objetivo de esta invención es usar ADN intacto o fragmentado de cualquier especie biológica, o incluso ADN creado mediante síntesis artificial, como elementos genéticos a integrarse en cromosomas artificiales mediante procesos de ensamblaje cromosómico in vivo o in vitro. Otro objetivo de esta invención es usar una capacidad de transformación natural, o sexo bacteriano (p.ej., conjugación o transducción), o medios artificiales (electroporación o modificación química de la membrana celular) para introducir ADN exógeno en las células seleccionadas como objetivo que experimentan la reparación del ADN. Esta reparación en desarrollo mediante ensamblaje de fragmentos se desencadena por la irradiación ionizante o ultravioleta, o por productos químicos que dañan el ADN (p.ej., mitomicina C) antes o después de la introducción del ADN exógeno en la célula bacteriana. Otro objetivo de esta invención es usar grandes fragmentos de ADN genómico o plasmídico que contienen operones completos de rutas biosintéticas que producen (i) moléculas pequeñas o proteínas terapéuticas útiles, (ii) actividades enzimáticas para la biodegradación o la biorreparación del medio o (iii) metabolismo generador de energía, por ejemplo aprovechando también la resistencia a la desecación extrema de D. radiodurans y lo inocua que es para los seres humanos. 2 Aún otro objetivo de esta invención es usar una fuente de actividad biológica según esta invención como vector para rutas de biodegradación y biorreparación naturales o modificadas mediante ingeniería genética. Aún otro objetivo de esta invención es usar este proceso de ingeniería cromosómica en extractos exentos de células, o con proteínas purificadas, para generar nuevos ensamblajes cromosómicos que se pueden transferir a las células adecuadas, o células sin ADN, por lo que se crean nuevas entidades biológicas. Estas nuevas entidades o especies biológicas se pueden usar como máquinas biológicas adaptadas para resolver problemas importantes para la humanidad, p.ej., la limpieza ambiental por medio de la biodegradación, la síntesis de nuevos agentes terapéuticos, la producción de energías limpias, etc. SUMARIO DE LA INVENCIÓN Esta invención se basa en una aproximación combinada mediante la cual la ingeniería cromosómica de una fuente de actividad biológica, y opcionalmente de una fuente exógena de material genético a recombinar, se hace factible basándose en una forma recién descubierta de reparación del ADN, que implica procesos de replicación y de recombinación del ADN mutuamente dependientes, uno de los cuales implica una "hibridación de cadenas dependiente de una síntesis prolongada" especial (ESDSA) para la reconstitución de cromosomas funcionales previamente fragmentados por la radiación o por una desecación considerable, mientras el otro hace uso de la recombinación homóloga. La fuente de actividad biológica usada según la invención se selecciona de manera ventajosa del grupo que consiste en: (a) una bacteria resistente a la radiación ionizante y/o a la desecación y/o al tratamiento químico, y que muestra una ruta de reparación, tras la radiación y/o la desecación y/o el tratamiento químico, y dicha ruta de reparación implica procesos tanto de ESDSA como de recombinación homóloga; (b) cualquier organismo vivo con una ruta de reparación del ADN similar; y (c) extractos exentos de células de una bacteria según el punto (a) o de un organismo vivo según el punto (b) anteriores, preparados a la actividad máxima de reparación del ADN celular. Una fuente ejemplar de actividad biológica según la invención es la bacteria Deinococcus radiodurans, que es una bacteria pequeña no esporulante y no patógena muy conocida. Según esta invención, se puede seleccionar una fuente exógena de material genético del grupo que consiste en, p.ej., ADNs de diversa naturaleza y/o origen, e incluso cualquier material genético de la biosfera. El proceso de ingeniería cromosómica según esta invención se puede usar, entre otros, para reensamblar el ADN fragmentado hasta cromosomas funcionales intactos, para integrar in vivo o in vitro ADN exógeno durante un proceso de reparación de ADN, para integrar elementos genéticos en un cromosoma bacteriano o en cromosomas artificiales, para la biodegradación y/o biorreparación natural o modificada mediante ingeniería genética, para la síntesis de compuestos nuevos, etc. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS ES 2 367 661 T3 La Fig. 1 es una representación de la reparación y síntesis del ADN tras irradiación gamma de D. radiodurans. A, C, E muestran la cinética de la reparación del ADN en cepas de tipo natural, polA y recA, respectivamente. B, D, F muestran, en la escala logarítmica, las velocidades respectivas de la síntesis de ADN. A: El carril (c) muestra los patrones de restricción de Not1 mediante PFGE de ADN de células de tipo natural no irradiadas, (0) inmediatamente tras la irradiación gamma de 7 kGy (los fragmentos de ADN son de alrededor de 25-30 kb) y de las células irradiadas cultivadas en medio rico durante 1,5, 3 y 4,5 h. (s) muestra... [Seguir leyendo]

1. Un proceso de ingeniería cromosómica, que comprende las etapas de: 1) proporcionar una bacteria resistente a la radiación y/o a la desecación y/o al tratamiento químico que tiene un mecanismo de reparación del ADN que comprende una etapa de hibridación de cadenas dependiente de una síntesis prolongada (ESDSA) y una etapa de recombinación homóloga dependiente de RecA; 2) inducir el mecanismo de reparación del ADN sometiendo a la bacteria a radiación, desecación y/o tratamiento químico que puede dañar el ADN, para fragmentar sustancialmente sus cromosomas hasta fragmentos cortos, y dicho mecanismo de reparación del ADN comprende: - hibridar colas monocatenarias complementarias prolongadas mediante la síntesis (ESDSA) que utiliza como molde fragmentos de ADN parcialmente solapantes de dichos cromosomas fragmentados, y - convertir los intermedios de ADN lineales largos resultantes en cromosomas circulares intactos, por medio de una recombinación homóloga dependiente de RecA; 3) insertar en los cromosomas fragmentados al menos una fuente exógena de material genético para que se convierta en parte integral del mismo durante el proceso de reparación del ADN de la etapa 2), y dicha fuente exógena de material genético comprende al menos un ADN seleccionado del grupo que consiste en ADN intacto o fragmentado de cualquier especie biológica o ADN creado mediante síntesis artificial; y 4) opcionalmente separar y recoger los cromosomas recombinados así obtenidos. 2. El proceso de la reivindicación 1, en el que la bacteria se expone a al menos una irradiación gamma de alrededor de 0,7 megarad (7 kGy) o a desecación. 3. El proceso de la reivindicación 1 ó 2, en el que la fuente exógena de material genético comprende operones completos que codifican rutas biosintéticas, p.ej. para la biodegradación de contaminantes ambientales, para la bioconversión de energía, o para la síntesis de antibióticos, proteínas terapéuticas u otros compuestos útiles. 4. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que los fragmentos de ADN exógeno comprenden prolongaciones en 3' sintéticas. 5. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el ADN exógeno se prolonga mediante síntesis o adición en los extremos mediante una ADN ligasa con una secuencia bacteriana elegida, preferiblemente que corresponde a una de sus secuencias IS, para ofrecer múltiples elecciones de integración inocua. 6. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que todos los fragmentos de ADN de cualquier fuente elegida de material genético o mezcla de materiales se prolonga mediante la misma secuencia de manera que, en la misma célula, estos fragmentos de ADN se pueden hibridar directamente en los extremos, en cualquier combinación posible, antes de integrarlos en el cromosoma. 7. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende el uso de al menos un medio seleccionado del grupo que consiste en la capacidad de transformación natural, sexo bacteriano, tal como la capacidad de conjugación o transducción, y medios artificiales, tales como electroporación o modificación química de la membrana celular, para introducir ADN exógeno en la bacteria viva que experimenta la reparación del ADN. 8. El proceso de la reivindicación 7, que comprende además desencadenar el proceso de reparación del ADN mediante irradiación ionizante o ultravioleta, o mediante productos químicos que dañan el ADN, tales como mitomicina C, antes o después de la introducción de ADN exógeno en la bacteria. 9. El uso de una bacteria resistente a la radiación y/o la desecación y/o el tratamiento químico que tiene un mecanismo de reparación del ADN que comprende una etapa de hibridación de cadenas dependiente de una síntesis prolongada (ESDSA) y una etapa de recombinación homóloga dependiente de RecA, para producir especies híbridas nuevas o cromosomas nuevos mediante recombinaciones intergenéricas y/o interespecíficas in vivo que comprende: - preparar ADN exógeno que está provisto de sitios de integración añadiendo adiciones terminales monocatenarias o bicatenarias idénticas, o similares, a cualquier sitio del cromosoma bacteriano en el que integrarse durante el proceso de reparación del ADN; - introducir dicho ADN exógeno en un cromosoma bacteriano durante un mecanismo de reparación del ADN, y dicho mecanismo de reparación del ADN comprende una etapa de hibridación de cadenas dependiente de una síntesis prolongada (ESDSA) y una etapa de recombinación homóloga dependiente de RecA. 10. El uso de la reivindicación 9, en el que la bacteria es Deinococcus radiodurans. 16 ES 2 367 661 T3 FIG 1: Cinética de la reparación del ADN y velocidad de síntesis del ADN 17 Absorción de 3 H-TdR (cpm) Absorción de 3 H-TdR (cpm) Absorción de 3 H-TdR (cpm) Tiempo de incubación (h) FIG 2: Análisis en gradiente de densidad del ADN reparado tras irradiación gamma en presencia de análogo pesado de 5-BrdU % de cpm totales ES 2 367 661 T3 Número de fracción Símbolos claros: cultivo no irradiado; símbolos rojos oscuros: irradiado, reparación de 3 h. A1-A3: ADN premarcado; B1-B3: ADN post-marcado; C1-C3: pre y post-marcado. A-C: gradientes de CsCl neutros; A1-C1: gradientes alcalinos; A2-C2: ADN sonicado, gradientes neutros. 18 ES 2 367 661 T3 FIG 3: LA ESTRUCTURA DE LOS CROMOSOMAS REPARADOS Síntesis reparativa en D. radiodurans -irradiadas revelada mediante fotolisis de ADN sustituido con 5-BrdU Carril 1: patrón de S. cerevisiae (225 2200 kpb) Carriles 2-7: ADN de D radiodurans thy ­ 2: sin irradiar, tiempo 0 3: irradiadas con 7 kGy, tiempo 0 4: 3h post-irradiación 5: 3 h post-irradiación + UV (1000 J/m 2 ) 6: 3 h post-irradiación + BUdR 7: 3 h post-irradiación + BUdR + UV (1000 J/m 2 ) 19 ES 2 367 661 T3 FIG 4: Mecanismos de SSA frente a SDSA para reparar ADN de D. radiodurans fragmentado mediante radiación ionizante ES 2 367 661 T3 DE 100 FRAGMENTOS HASTA EL CROMOSOMA REPARADO: Implicación de dos mecanismos de reparación por recombinación del ADN en D. radiodurans 21