PROCEDIMIENTOS DE CRIBADO DE AGENTES PARA ACTIVIDAD USANDO TELEÓSTEOS.

Procedimientos de cribado de agentes para actividad usando teleósteos ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN ES 2 367 324 T3 [0001] En la actualidad, las búsquedas de compuestos terapéuticos y profilácticos de dianas específicas que tienen la capacidad para mejorar o inhibir la actividad de la angiogénesis, mejorar o inhibir la actividad de la muerte celular, y/o presentan baja toxicidad comprenden tres principales focos de descubrimiento y desarrollo de fármacos. La angiogénesis juega un papel importante no sólo en el desarrollo de la vascularización embrionaria, sino también en muchos procesos de post-natales, tales como la cicatrización de heridas y tejidos y la regeneración de órganos. La angiogénesis también ha sido identificada como un proceso crítico para el crecimiento de tumores sólidos. Además, la proliferación incontrolada de células sanguíneas y una angiogénesis excesiva se han demostrado que constituyen componentes patogénicos importantes en numerosas enfermedades, incluyendo artritis reumatoide, aterosclerosis, diabetes mellitus, retinopatías, psoriasis, y fibroplasia retrolental. [0002] Los procedimientos de cribado de agentes para una capacidad de inhibir o mejorar la actividad de la angiogénesis podrían ser útiles en la identificación de aquellos agentes que podrían ser efectivos en el tratamiento terapéutico o profiláctico de una variedad de enfermedades que afectan a los procesos de angiogénesis. Por ejemplo, la inhibición de la angiogénesis es un poderoso enfoque potencial para aminorar el cáncer (Folkman, New Eng. J. Med. 333:1757-1763 (1995); Kerbel, Nature 390:355 (1997)) y para la pérdida de inversión de los vasos sanguíneos asociados con isquemia tisular, tal como la retinopatía diabética (Bonn, Lancet 348:604 (1996); Breier et al., Haemist 78 (1):678-683 (1997). Parece que las terapias anti-angiogénicas no provocan resistencia adquirida de los fármacos (Boehm et al, Nature 390:404-407 (1997)) - un gran problema con las terapias actuales contra el cáncer. Sin embargo, existen pocas moléculas candidatas terapéuticas. Por lo tanto, sería deseable proporcionar procedimientos para identificar compuestos que inhiben la angiogénesis y tengan actividades terapéuticas contra enfermedades que podrían beneficiarse de la inhibición de la angiogénesis, tal como el cáncer y la diabetes. De manera similar, los procedimientos de cribado de compuestos que mejoran la angiogénesis mediante la estimulación de la formación de vasos sanguíneos sería una ventaja para su uso en enfoques mínimamente invasivos para mejorar la función circulatoria en varias enfermedades, tales como enfermedad arterial coronaria, insuficiencia cardíaca congestiva, enfermedad arterial periférica y enfermedad venosa periférica. Desafortunadamente, muchos ensayos actuales para la angiogénesis no permiten la evaluación in vivo de los compuestos o sus efectos secundarios en modelos animales completos, o en múltiples tejidos u órganos de modelos animales simultáneamente y a lo largo del tiempo. Además, muchos de los ensayos actuales para la actividad de la angiogénesis no son adecuados para el cribado de compuestos rápido, automatizado, o extensivo, particularmente el cribado de librerías de compuestos que contienen numerosos compuestos, debido a su complejidad. [0003] La búsqueda de compuestos que puedan regular la promoción o inhiban la muerte celular también ha sido de vital interés. La necrosis y la apoptosis son dos tipos conocidos de muerte celular. La necrosis implica la muerte patológica de tejido vivo en un sujeto debido a daños no fisiológicos en las células de los tejidos. La apoptosis, que implica la muerte celular programada, es un proceso fisiológico que asegura que se mantiene un equilibrio entre la proliferación y la diferenciación celular en la mayoría de los tejidos auto-regenerativos de los organismos multicelulares. La regulación de la actividad de la muerte celular (apoptosis en particular) constituye un mecanismo importante en los enfoques terapéuticos y profilácticos para muchas enfermedades, incluyendo, por ejemplo, el cáncer y el trasplante de órganos. Los modelos existentes para evaluar la actividad de la apoptosis incluyen el gusano nematodo, C. elegans. Aunque el nematodo tiene muchas ventajas como un sistema modelo, no es el modelo óptimo para la evaluación de la actividad de la muerte celular en los vertebrados o para su uso en el cribado de compuestos de potencial actividad terapéutica en los vertebrados. [0004] Actualmente hay dos enfoques para detectar la actividad de la muerte celular en huéspedes vertebrados. El primer enfoque utiliza técnicas de cultivo de células estándar y típicamente se basa en lectores de microplacas estándar para detectar la muerte de las células cultivadas a partir de un organismo. Una gran desventaja del formato de ensayo del cultivo celular es que no permite un análisis de los efectos de un compuesto en tipos de células que no han sido cultivadas (es decir, otros tipos de células). Tampoco permite una evaluación de los efectos de un compuesto en los tejidos u órganos específicos o en un huésped completo intacto in vivo. Además, este formato de ensayo no permite la monitorización de las actividades de la muerte celular en múltiples tejidos, órganos o sistemas de un huésped vivo de manera simultánea o la monitorización continua de tales actividades a lo largo del tiempo. Además, el enfoque de ensayo de cultivo de células no permite un cribado rápido y automatizado de alto rendimiento de muchos compuestos. [0005] Un segundo enfoque para detectar la actividad de la muerte celular utiliza una técnica de tinción histoquímica, etiquetado final de nucleótidos de desoxiuridina de terminal designado (TUNEL), para detectar las células muertas o moribundas en tejidos seccionados de embriones de vertebrados. Desafortunadamente, con este enfoque, solamente un único punto en el tiempo en el ciclo de vida del huésped puede ser examinado; la muerte de células en diferentes tejidos u órganos del sujeto durante un período de tiempo no se puede monitorizar. Debido a que muchas enfermedades degenerativas se producen en etapas, la capacidad de examinar los cambios en el patrón de la actividad de la muerte celular causada por un compuesto y la duración de los efectos directos y secundarios de los compuestos 2 en múltiples tejidos y órganos representaría una mejora significativa sobre estos procedimientos. Por otra parte, debido a que el enfoque TUNEL requiere que las células se fijen para su visualización, los efectos en un animal vivo no pueden ser monitorizados. [0006] La identificación de compuestos terapéuticos y profilácticos para dianas específicas que presentan baja toxicidad y/o efectos secundarios ha sido también el centro de descubrimiento y desarrollo de fármacos. La evaluación del impacto potencial de diferentes compuestos en los seres humanos y en la salud animal es un componente importante de la evaluación de riesgos. Existe una creciente preocupación de que los actuales procedimientos de ensayo de toxicidad sean insuficientes. Una serie de cribados de toxicidad in vitro basados en células se han desarrollado. Significativamente, sin embargo, estos cribados no permiten la evaluación de los efectos tóxicos de un compuesto in vivo en un animal intacto. En particular, estos ensayos basados en células han sido diseñados a nivel molecular y celular, y como resultado, la determinación del impacto de un compuesto de interés en niveles más altos de la organización celular, tales como el sistema circulatorio y neurológico, aún requiere pruebas posteriores en el animal completo. Además, los cribados actuales no permiten la evaluación de los efectos de los fármacos en todas las células, tejidos u órganos diana potenciales de un animal. Tampoco pueden los efectos de un compuesto en múltiples tejidos y órganos diana estudiarse simultáneamente o a lo largo del tiempo utilizando los ensayos actuales. Subrayando la necesidad de desarrollo de procedimientos de cribado de toxicidad más predictivos y comprensivos, muchos compuestos que pasan las pruebas preliminares basadas en células no superan las pruebas definitivas de toxicidad en animales, un requisito previo para su eventual aprobación por parte de la FDA. Además, algunos compuestos terapéuticos potenciales que no producen una mortalidad inmediata inducen efectos tóxicos en órganos y tejidos específicos. Hay una necesidad de procedimientos comprensivos y rentables para el cribado de compuestos para la actividad tóxica en animales completos y en uno o más tejidos diana designados y en órganos in vivo y en células in vitro y a lo largo del tiempo. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN ES 2 367 324 T3 [0007] La presente invención se refiere en general a procedimientos de cribado de un agente para una actividad... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de cribado de un agente para una actividad, comprendiendo el procedimiento: cultivar un teleósteo en una solución en un pocillo de una microplaca; añadir el agente a la solución, con lo que el agente impregna el teleósteo; y determinar si el agente tiene la actividad en el teleósteo. ES 2 367 324 T3 2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el agente se añade a una solución que contiene el teleósteo. 3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el agente primero se disuelve en la solución y el teleósteo posteriormente se sumerge en la solución que contiene el agente. 4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el agente se administra al teleósteo en conjunción con al menos otro compuesto. 5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende el uso de los instrumentos automatizados de manipulación de líquidos. 6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que una pluralidad de agentes son cribado para la actividad. 7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que una librería de agentes se criba para la actividad. 8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que un lector de microplacas se utiliza para detectar una señal de la microplaca. 9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el teleósteo es un embrión de teleósteo completo. 10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que también comprende la administración de un tinte al teleósteo, en el que el tinte se utiliza para la detección de una respuesta en el teleósteo que indica la actividad. 11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que una señal para la detección de la actividad se genera mediante la tinción de anticuerpos de una proteína específica. 12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que una señal para la detección de la actividad se genera mediante hibridación in situ. 13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el pocillo contiene un único embrión de teleósteo. 14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que también el pocillo contiene múltiples embriones de teleósteos. 15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el teleósteo es un pez cebra. 16. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el teleósteo es un embrión. 17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el teleósteo es una larva o un adulto. 18. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que también comprende la evaluación de si el agente tiene una actividad tóxica en el teleósteo. 19. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que la actividad tóxica se evalúa en uno o más órganos, por ejemplo, el riñón, páncreas, sistema cardiovascular, sistema nervioso central, o el hígado del teleósteo, simultáneamente o de forma independiente. 20. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la actividad del agente se criba para una capacidad de aumentar o inhibir la angiogénesis. 21. Procedimiento según la reivindicación 18-20, en el que el procedimiento también comprende la evaluación de si el agente aumenta o inhibe la muerte celular en el teleósteo. 22. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el teleósteo se cultiva en un volumen de solución tan pequeño como 100 l. 23. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el teleósteo se cultiva en un volumen de solución de 500 l. 44 ES 2 367 324 T3 24. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el teleósteo es un teleósteo mutante o transgénico. 25. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el agente es una molécula pequeña. 26. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el agente es un ácido nucleico, 5 opcionalmente ADN o ARN , un péptido, una proteína, glicoproteína, carbohidrato, lípidos o glicolípido. 27. Procedimiento según la reivindicación 18, que también comprende la inspección visual del teleósteo para viabilidad, graves defectos morfológicos, ritmo cardíaco y circulación. 28. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que los embriones de teleósteos a las 24 horas de desarrollo con corion están expuestos continuamente durante cinco días a los compuestos químicos a diferentes concentraciones de 10 los compuestos químicos y controles. 29. Utilización de una placa de microtitulación e instrumentación automatizada para el cribado de un agente para la actividad en un pez cebra. ES 2 367 324 T3 46 ES 2 367 324 T3 47 ES 2 367 324 T3 48 ES 2 367 324 T3 49 ES 2 367 324 T3