PROCEDIMIENTO QUIMO-ENZIMATICO PARA LA SINTESIS DE 1-DEOXI-D-XILULOSA.
Procedimiento quimo-enzimático para la síntesis de 1-deoxi-D-xilulosa.
Procedimiento para la obtención de 1-deoxi-D-xilulosa que comprende la adición aldólica de benciloxiacetaldehído a hidroxiacetona catalizado por FSA para obtener 5-O-bencil-1-deoxi-D-xilulosa; y posterior eliminación del grupo bencilo del aducto, 5-O-bencil-1-deoxi-D-xilulosa, mediante hidrogenolisis catalítica para dar lugar a 1-deoxi-D-xilulosa
Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200900254.
Solicitante: CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS (CSIC)
BIOGLANE, S.L.N.E.
Nacionalidad solicitante: España.
Provincia: MADRID.
Inventor/es: LOZANO PEREZ,CARLES, JOGLAR TAMARGO,JESUS, CASTILLO EXPOSITO,JOSE ANTONIO, CONCIA,ALDA LISA, CLAPES SABORIT,PEDRO.
Fecha de Solicitud: 29 de Enero de 2009.
Fecha de Publicación: .
Fecha de Concesión: 8 de Junio de 2011.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C07C45/45 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07C COMPUESTOS ACICLICOS O CARBOCICLICOS (compuestos macromoleculares C08; producción de compuestos orgánicos por electrolisiso electroforesis C25B 3/00, C25B 7/00). › C07C 45/00 Preparación de compuestos que tienen grupos C=O unidos únicamente a átomos de carbono o hidrógeno; Preparación de los quelatos de estos compuestos. › por condensación.
- C07C49/17 C07C […] › C07C 49/00 Cetonas; Cetenas; Dímeros de cetena; Quelatos de cetona. › conteniendo grupos hidroxilo.
- C07H3/02 C07 […] › C07H AZUCARES; SUS DERIVADOS; NUCLEOSIDOS; NUCLEOTIDOS; ACIDOS NUCLEICOS (derivados de ácidos aldónicos o sacáricos C07C, C07D; ácidos aldónicos, ácidos sacáricos C07C 59/105, C07C 59/285; cianohidrinas C07C 255/16; glicales C07D; compuestos de constitución indeterminada C07G; polisacáridos, sus derivados C08B; ADN o ARN concerniente a la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos o su aislamiento, preparación o purificación C12N 15/00; industria del azúcar C13). › C07H 3/00 Compuestos que contienen solamente átomos de hidrógeno y radicales sacárido que tienen solamente átomos de carbono, hidrógeno y oxígeno (preparación por hidrólisis de di- o polisácaridos C13; separación o purificación de sucrosa, glucosa, fructosa, lactosa o maltosa C13). › Monosacáridos.
- C12P7/26 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA. › C12P 7/00 Preparación de compuestos orgánicos que contienen oxígeno. › Cetonas.
Clasificación PCT:
PDF original: ES-2343448_B1.pdf
Fragmento de la descripción:
Procedimiento quimo-enzimático para la síntesis de 1-deoxi-D-xilulosa.
La presente invención se refiere a un procedimiento quimo-enzimático para la síntesis de 1-deoxi-D-xilulosa. Por tanto, la invención se encuadra en el sector químico y biotecnológico.
Estado de la técnica
La 1-deoxi-D-xilulosa es una pentulosa de gran importancia pues se incorpora con facilidad a la ruta metabólica del mevalonato (independiente de metileritriol fosfato) para la biosíntesis de isoprenoides, que tienen lugar en bacterias y plantas. El interés en la biosíntesis de difosfato de tiamina, fosfato de piridoxal e isoprenoides ha despertado muchas expectativas en la 1-deoxi-D-xilulosa para usos biotecnológicos. Por ejemplo la 1-deoxi-D-xilulosa es particularmente valiosa en la producción biotecnológica de terpenos, ketocarotenoides o vitamina B6, entre otros productos de interés.
En la actualidad existen diferentes síntesis quimo-enzimáticas para la obtención de 1-deoxi-D-xilulosa. Algunos de los métodos de síntesis de este compuesto tienen un número de etapas elevado. En una de estas síntesis se describe la reacción entre un tioanálogo del fosfato de dihidroxiacetona (DHAP) y la hidroxiacetona (HA), biocatalizada con la enzima fructosa bifosfato aldolasa (Duncan, R.; Drueckhammer, D. G., (1996), J. Org. Chem., 61, (2), 438-439), obteniéndose el compuesto mediante unas cuatro etapas de síntesis. Además, como consecuencia de que el procedimiento tenga al menos cuatro etapas, los rendimientos globales de síntesis no son muy altos.
En otros procedimientos de síntesis se han utilizado anticuerpos monoclonales como catalizadores (Shabat, D., et al., (1999), Tetrahedron Lett.. 40, (8), 1437-1440), como el anticuerpo monoclonal Ab 38C2. En estos momentos los anticuerpos monoclonales como catalizadores están en desuso debido a su compleja obtención y los pobres resultados en cuanto a eficiencia catalítica. En el caso del uso de Ab 38C2, el rendimiento de la reacción catalítica es de un 32% y el rendimiento global es del 23% sin contar con las etapas de purificación.
En consecuencia, el encontrar una metodología simple y efectiva para la producción de 1-deoxi-D-xilulosa es de clara importancia estratégica para la producción de metabolitos importantes a partir de cultivos de plantas o bacterias.
Descripción de la invención
La presente invención proporciona un procedimiento quimo-enzimático útil para la preparación de 1-deoxi-D-xilulosa basado en la utilización de la enzima D-fructosa-6-fosfato aldolasa (FSA).
Un primer aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento para la obtención de 1-deoxi-D-xilulosa (esquema 1), que comprende las siguientes etapas:
a) la adición aldólica de benciloxiacetaldehído a hidroxiacetona catalizado por FSA para obtener 5-O-bencil-1-deoxi-D-xilulosa; y
b) eliminación del grupo bencilo del aducto, 5-O-bencil-1-deoxi-D-xilulosa, mediante hidrogenolisis catalítica para dar lugar a 1-deoxi-D-xilulosa.
La hidrogenolisis catalítica del paso (b) del procedimiento de la invención consiste en la adición de H2 en presencia de un catalizador, preferiblemente un catalizador metálico.
"Catalizador metálico" se refiere en esta invención a un catalizador cuya función en procesos de hidrogenación es conocida por un experto en la materia. Preferiblemente este catalizador metálico se puede seleccionar del grupo que comprende Pd, Ni, Pt, Ru o Rh. Más preferiblemente el catalizador metálico es Pd/C.
El procedimiento de la invención presenta ventajas con respecto a las síntesis quimo-enzimáticas existentes en el estado de la técnica, al tener un número de etapas menor, rendimientos globales más altos y una muy alta estereoquímica. Así, por ejemplo:
- la FSA utiliza HA en la reacción de adición aldólica en lugar del tioanálogo de DHAP, eliminándose un total de 4 etapas sintéticas (sin contar la preparación del tioanálogo de DHAP y del benciloxiacetaldehído) en comparación con la metodología con aldolasas DHAP-dependientes, mencionadas en los antecedentes. En la presente invención se elimina el paso de hidrólisis del grupo tiofosfato.
- La obtención y purificación de la FSA es simple y de bajo coste. Como biocatalizador la FSA es estable a 4ºC como mínimo durante siete meses sin perdida de actividad, y además no utiliza ni genera residuos tóxicos, como sí ocurre, por ejemplo, en el caso de utilizar las DHAP-aldolasas, al emplear dihidroxiacetona (DHA) en presencia de sales de arsénico, producto altamente tóxico y, por tanto, peligroso para la salud y el medio ambiente.
- El benciloxiacetaldehído como sustrato da lugar a una reacción aldólica altamente estereoselectiva, mientras que la utilización de glicolaldehído da lugar a epimerización del producto en C3. De esta forma, se procedió a una síntesis según el esquema 1 utilizando glicolaldehído, dando lugar a un 51% de rendimiento global de un material que es mezcla 80:20 de dos diastereoisomeros tal y como se indica:
Esquema 1
mientras que el rendimiento global del proceso de síntesis descrito en la presente invención, utilizando benciloxiacetaldehído, es de un 70%.
- FSA tiene capacidad de controlar la estereoquímica de la adición aldólica y, por tanto, la configuración de los nuevos centros estereogénicos creados depende del enzima y no de los reactivos de la adición aldólica.
Es conocida la capacidad sintética de la FSA de catalizar la adición aldólica entre la DHA y el gliceraldehído-3-fosfato para formar fructosa-6-fosfato (Schürmann, M.; Sprenger, G. A. (2001) J. Biol. Chem. 276, 11055). También es conocida su capacidad sintética en adiciones aldólicas de DHA con otros aldehídos tipo glicolaldehído, D-gliceraldehído y D-eritrosa. Sin embargo, en ningún caso los aductos de adición aldólica catalizados por FSA fueron caracterizados inequívocamente por técnicas espectroscópicas ni la estereoquímica de estos aductos resuelta. Por tanto, no podía deducirse a priori que el aldehído de benciloxiacetaldehído fuera sustrato o reactivo de la FSA ni que la estereoquímica final de la reacción fuera la adecuada para el producto de la presente invención.
En una realización preferida de la presente invención, la enzima D-fructosa-6-fosfato aldolasa se corresponde con la FSA de E. coli de SEQ ID NO:1.
En dicha realización preferida de la presente invención, la FSA utilizada ha sido clonada en la cepa E. coli MC4100, derivada de la cepa de E. coli K-12 (Schürmann, M.; Sprenger, G. A. J. Biol. Chem. (2001) 276 11055; Casadaban, M. J. (1976) J. Mol. Biol. 104, 541-555) y purificada posteriormente. Dicha FSA consiste en la forma salvaje de enzima D-fructosa-6-fosfato aldolasa que de forma natural se expresa en E. coli y cuya secuencia de aminoácidos se corresponde con la SEQ ID NO:1. Cualquier otra enzima D-fructosa-6-fosfato aldolasa (FSA) salvaje puede ser aislada e identificada en otros microorganismos gracias a la información y procedimientos existentes en el estado de la técnica y a la descripción de la presente invención. Por lo tanto, una realización preferida de la presente invención lo constituye el procedimiento de invención donde la enzima FSA es una enzima de secuencia análoga a la SEQ ID NO:1.
En el sentido utilizado en esta descripción, el término "análoga" pretende incluir cualquier secuencia de aminoácidos que pueda ser aislada de un microorganismo o por mutagénesis dirigida y que posea la capacidad de adición aldólica entre la DHA y un benciloxiacetaldehído aceptor. En general, una secuencia de aminoácidos análoga es sustancialmente homóloga a la secuencia de aminoácidos comentada anteriormente. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "sustancialmente homóloga" significa que las secuencias de aminoácidos en cuestión tienen un grado de identidad de, al menos, un 30%, preferentemente de, al menos, un 75%, más preferentemente de, al menos, un 85%, o aún más preferentemente de, al menos, un 95%.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Procedimiento de obtención de 1-deoxi-D-xilulosa que comprende las siguientes etapas:
2. Procedimiento según la reivindicación 1, donde en el paso (b) la hidrogenólisis se lleva a cabo en presencia de un catalizador metálico seleccionado del grupo que comprende Pd, Ni, Pt, Ru o Rh.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, donde el catalizador es Pd/C.
4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la enzima FSA del paso (a) tiene la secuencia aminoacídica SEQ ID NO:1.
5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde FSA es una enzima cuya secuencia aminoacídica presenta una identidad de al menos un 75% con SEQ ID NO:1.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, donde FSA es una enzima cuya secuencia aminoacídica presenta una identidad de al menos un 85% con SEQ ID NO:1.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, donde FSA es una enzima cuya secuencia aminoacídica presenta una identidad de al menos un 95% con SEQ ID NO:1.
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