Procedimiento miniaturizado en placas multipocillo para analizar la unión de ligandos a ácidos nucleicos mediante la obtención de curvas de fusión térmica.

Se describe un procedimiento miniaturizado en placas multipocillo para analizar la unión de ligandos a ácidos nucleicos mediante curvas de fusión térmica. Para conseguir la miniaturización se utilizan estrategias de marcaje fluorescente que permitan la determinación de la proporción de complejos asociados y disociados en fase homogénea. Las mezclas de reacción a analizar se disponen en distintos pocillos de una placa multipocillo. A continuación se somete la placa a un incremento de temperatura gradual programado en el tiempo, tomando lecturas de intensidad de fluorescencia de cada pocillo tras cada paso de incremento de temperatura. Puede ejecutarse también un programa de disminución gradual de temperatura, igualmente tomando lecturas de intensidad de fluorescencia con cada cambio. El cambio programado de temperatura y lectura de intensidad de emisión de fluorescencia se puede realizar en un aparato de PCR de tiempo real u otros equipos que permitan realizar dichas operaciones sobre placas multipocillo

Procedimiento miniaturizado en placas multipocillo para analizar la unión de ligandos a ácidos nucleicos mediante la obtención de curvas de fusión térmica.

Sector de la técnica

El procedimiento descrito en esta patente tiene aplicaciones en el análisis y caracterización de la interacción con ADN de compuestos con capacidad de unión a ésta macromolécula. Igualmente es aplicable a otros ácidos nucleicos como ARN, híbridos ADN-ARN, derivados o análogos de cualquiera de estos. El procedimiento miniaturizado que se describe permite estudiar la unión de un determinado ligando a oligonucleótidos de diferentes secuencias o de una colección de ligandos, estructuralmente relacionados o no, con oligonucleótidos de igual o diferente secuencia. El estudio comparativo de la unión de un determinado ligando a diferentes secuencias puede aplicarse a la determinación de la especificidad o preferencia de secuencia de dicha unión. El mismo tipo de estudio permite igualmente determinar diferencias de estabilidad local de los complejos formados.

La rapidez, bajo coste relativo y facilidad de automatización o robotización de este ensayo, en comparación con otros métodos de determinación de interacciones entre ligandos y ácidos nucleicos, permite o facilita la aplicación de este procedimiento a casi cualquier estudio que implique la interacción covalente o no covalente de ligandos con oligonucleótidos, tanto si dicha interacción es un fin en sí misma como si se trata de un medio para estudiar otros parámetros. Un ejemplo de esto último podría ser un estudio de estabilidad o mantenimiento de la capacidad funcional de un determinado compuesto con aplicación farmacológica que actúa mediante unión al ADN.

El estudio de la unión de ligandos al ADN es un proceso de utilidad muy diversa en el campo de la química, la biología y la medicina, tanto para fines de investigación como diagnósticos, así como en otros campos afines a estos.

Este método tiene una aplicabilidad a una gran variedad de compuestos y modos de interacción con ácidos nucleicos, por lo que puede emplearse para la búsqueda de nuevos compuestos con capacidad de unión a ADN u otros ácidos nucleicos. Esto es de especial interés en la búsqueda de fármacos que tengan a estas moléculas como diana, o bien de ligandos para mareaje y localización de ácidos nucleicos.

Estado de la técnica

Hasta la actualidad se han descrito numerosos procedimientos y aparatos que permiten realizar diversas formas de caracterización de la unión de ligandos al ADN.

La mayor parte de los métodos descritos no son susceptibles de miniaturización ni procesamiento paralelo que permita su aplicación para un gran número de muestras. En dichos métodos el consumo de reactivos y tiempo de realización o manipulación es elevado, por lo que no pueden aplicarse para el estudio de diversos compuestos y/o secuencias nucleotídicas. Cabe citar, entre este tipo de métodos, las técnicas calorimétricas, las electroforéticas (electroforesis en gel, capilar), el footprinting, las técnicas espectrofotométricas (como la espectrofotometría ultravioleta-visible, el dicroísmo circular o la fluorimetría), la cristalografía (o difracción de rayos X) y la resonancia magnética nuclear (o RMN). Todos estos métodos tienen su campo de aplicación específico, así como sus ventajas y capacidades en el estudio de la interacción de ligandos con ácidos nucleicos, pero requieren cantidades relativamente elevadas de reactivos, equipamientos poco frecuentes y costosos o procesamiento secuencial de las muestras. Pueden llegar a proporcionar mucha información y muy precisa sobre el proceso en estudio, pero no comparten el campo de aplicación práctica con el método descrito en esta patente puesto que no pueden aplicarse de forma realista a un número elevado de ensayos, por ejemplo a colecciones de muchos compuestos o sobre muchas secuencias de ácido nucleico, o en situaciones donde no hay gran disponibilidad de los compuestos a analizar o el tiempo dedicable a cada ensayo es limitado.

El procedimiento descrito en esta patente tiene como único antecedente relacionado la utilización de un aparato de PCR en tiempo real (termociclador) para la lectura de la disociación del ADN marcado con fluorescencia (referencias 1 a 4). En estos trabajos describen el uso de un termociclador para PCR en tiempo real que trabaja con mezclas de reacción contenidas en tubos capilares individuales que se introducen en una pieza en forma de carrusel rotativo que aloja hasta 32 tubos (LightCycler®, Roche).

No se ha encontrado ninguna descripción de un ensayo de unión de ligandos a ácidos nucleicos mediante análisis de curvas de fusión térmica en placa multipocillo. Esta es la novedad y utilidad fundamental, sencilla pero no obvia, que aporta el procedimiento descrito y reivindicado en esta patente. Todas las demás reivindicaciones son derivadas de ésta.

Referencias citadas

1. Procedimiento analítico miniaturizado y realizado en placas multipocillo para detectar el efecto de ligandos no covalentes, reactivos covalentes o condiciones físico-químicas de una mezcla de reacción sobre las propiedades de las interacciones no covalentes que mantienen una asociación entre cadenas o partes de una cadena de ácidos desoxirribonucleico, ribonucleico, moléculas o complejos híbridos o derivados de cualquiera de estos, basado en la modificación de la medición experimental del cambio con la temperatura de la constante de equilibrio aparente de la reacción global, simple o múltiple, de asociación-disociación entre las mencionadas cadenas de ácido nucleico.

2. Método, según la reivindicación 1, caracterizado por aplicarse a la determinación de la capacidad de unión de un determinado ligando o reactivo a un ácido nucleico o derivado.

3. Método, según las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado por aplicarse a la determinación de la capacidad de unión de dicho ligando o reactivo a la forma simplexa o de hebra sencilla de dicho ácido nucleico o derivado.

4. Método, según las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado por aplicarse a la determinación de la capacidad de unión de dicho ligando o reactivo a la forma duplexa o de doble hebra de dicho ácido nucleico o derivado.

5. Método, según las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por aplicarse a determinar la preferencia de unión del ligando o reactivo a la forma simplexa o duplexa de un ácido nucleico o derivado con una secuencia de bases determinada.

6. Método, según la reivindicación 1, caracterizado por aplicarse a determinar el grado de estabilización de la forma duplexa de un ácido nucleico o derivado inducido por la unión de un determinado ligando o reactivo.

7. Método, según la reivindicación 1, caracterizado porque la cuantificación de la fracción de moléculas de ácido nucleico o derivado en forma duplexa presentes en la mezcla de reacción a cada temperatura se realiza mediante la inclusión en dicha mezcla de un ligando fluorescente auxiliar cuyas propiedades de fluorescencia cambian al estar unido al ácido nucleico respecto del estado libre.

8. Método, según la reivindicación 7, caracterizado porque el ligando fluorescente auxiliar es SYBR Green.

9. Método, según la reivindicación 1, caracterizado porque la cuantificación de la fracción de moléculas de ácido nucleico o derivado en forma duplexa presentes en la mezcla de reacción a cada temperatura se realiza gracias a un mareaje covalente con uno o más grupos cromóforos, fluorescentes o no fluorescentes, en una o ambas hebras de dicho ácido nucleico.

10. Método, según la reivindicación 9, caracterizado porque el grupo o grupos marcadores se encuentran unidos covalentemente a uno o ambos extremos (5-prima y/o 3-prima o equivalentes) de una o ambas cadenas de ácido nucleico o derivado.

11. Método, según la reivindicación 9, caracterizado porque se emplean dos grupos fluorescentes distintos con propiedades espectroscópicas tales que la emisión de fluorescencia del primero es absorbida o extinguida por el segundo, estando cada uno de ellos unido a una de las hebras del ácido nucleico o derivado, de modo que en el estado duplexo se encuentran ambos grupos en proximidad y la intensidad de emisión de fluorescencia del primero resulta disminuida como consecuencia de la extinción por el segundo.

12. Método, según la reivindicación 11, caracterizado porque dichos dos grupos fluorescentes distintos se encuentran unidos a los extremos de cada cadena complementaria de ácido nucleico.

13. Método, según la reivindicación 11, caracterizado porque dichos dos grupos fluorescentes distintos se encuentran unidos a los extremos opuestos, 5-prima y 3-prima, de cada cadena complementaria de ácido nucleico, de modo que en la estructura duplexa del ácido nucleico se sitúan ambos grupos muy próximos en el espacio.

14. Método, según las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13, caracterizado porque se emplea un oligonucleótido con secuencia total o parcialmente autocomplementaria que forme dímeros o estructuras en horquilla.