PÉPTIDOS DE TRANSITO DE PLASTIDIO.

Un péptido de tránsito de plastidio aislado seleccionado entre:

(a) un péptido que comprende cualquiera entre SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO:46. (b) un péptido que es idéntico al menos en un 95% a la secuencia de aminoácidos de cualquiera entre SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO:46. (c) un péptido que está codificado por una molécula de ácido nucleico que se hibrida con una sonda de ácido nucleico que consiste en la secuencia de nucleótidos de cualquiera de las moléculas de ácido nucleico que codifica cualquiera entre SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO:46, o un complemento del mismo después de al menos un lavado en 0,2X SSC a 55ºC durante 20 minutos; (d) un fragmento que comprende al menos un 90% de los radicales de aminoácido consecutivos de cualquiera entre SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO:46

CAMPO DE LA INVENCIÓN [0001] La presente invención se encuadra de forma general en el campo de la inserción dirigida de proteínas y proporciona péptidos que dirigen la localización de polipéptidos unidos hacia plastidios vegetales. La presente invención se refiere también a métodos y composiciones para localizar polipéptidos en plastidios vegetales, incluyendo, pero sin limitarse sólo a ellos producción de plantas transgénicas.

2. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN [0002] Los péptidos de tránsito de plastidio son extensiones N-terminales que facilitan la inserción dirigida y translocalización de proteínas precursoras sintetizadas citosólicamente en plastidios a través de un mecanismo posttransduccional (revisado por Bruce, Bichim. Biophys. Acta 1541:2-21 (2001)). Una vez que se ha completado toda la secuenciación del genoma Arabidopsis, se estima que se insertan dirigidamente más de 3500 proteínas diferentes en los plasmidios durante la vida de una planta típica. El desarrollo de un modelo sobre cómo funcionan todas estas secuencias de inserción dirigida para apuntar a la inserción dirigida apropiada ha resultado difícil, ya que son muy divergentes al nivel de secuencia primaria en lo que se refiere a la longitud, la composición y la organización. La información estructural secundaria y terciaria está disponible solamente para algunos péptidos de tránsito de plastidio, y los resultados difieren significativamente dependiendo sobre si los experimentos se llevaron a cabo en un entorno acuoso o de imitación de la membrana. Por lo tanto, no se ha delineado claramente ninguna característica estructural o propiedad.[0003] La capacidad de insertar dirigidamente proteínas recombinantes en diferentes compartimentos subcelulares en plantas transgénicas constituye una importante parte de la ingeniería genética de la planta. Por ejemplo, muchos procesos fisiológicos de la planta muy importantes tienen lugar en los plastidios, incluyendo, sin limitarse sólo a ellos, la fotosíntesis, la síntesis de ácidos grasos, la síntesis de aminoácidos, la biosíntesis de carotenoides, la biosíntesis de terpenoides, y la biosíntesis de almidón. Así pues, existe la necesidad de poder insertar dirigidamente polipéptidos recombinantes en plastidios para modular o alterar los procesos fisiológicos que tienen lugar en los plastidios. Adicionalmente, algunos polipéptidos son tóxicos cuando se expresan recombinantemente en el citoplasma. Dado que los plastidios son compartimientos subcelulares, es posible insertar dirigidamente polipéptidos recombinantes en los plastidios para secuestrarlos del citoplasma, permitiendo así mayores niveles de expresión. Por otra parte, la expresión de polipéptidos recombinantes en plastidios puede facilitar el aislamiento del polipéptido para diversas aplicaciones.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN [0004] La presente invención se refiere a nuevos péptidos de tránsito de plastidio seleccionados entre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, y SEQ ID Nº: 46. Por otra parte, se apreciará que los péptidos de la invención también abarcan ciertas variantes, derivados y análogos de estas secuencias tal como se definen en las reivindicaciones, así como moléculas de ácido nucleico que codifican las secuencias de la invención. [0005] Por consiguiente, la invención proporciona un péptido de tránsito de plastidio aislado seleccionado entre:

a) un péptido que comprende cualquiera entre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, y SEQ ID Nº: 46;

b) un péptido que es idéntico al menos en un 95% a la secuencia de aminoácidos de cualquiera entre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, y SEQ ID Nº: 46;

c) un péptido que está codificado por una molécula de ácido nucleico que se hibrida con una sonda de ácido nucleico que consiste en la secuencia de nucleótido de cualquiera de las moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera entre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, y SEQ ID Nº: 46, o un complemento del mismo tras al menos un lavado en 0,2 x SSC a 55ºC durante 20 minutos.

d) un fragmento que comprende al menos un 90% de radicales de aminoácido consecutivos de cualquiera entre SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, y SEQ ID Nº: 46. [0006] La invención proporciona también un polipéptido de fusión que comprende dicho péptido.[0007] La invención proporciona también un polipéptido de fusión que comprende el péptido de la reivindicación 1.[0008] La invención proporciona también una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido de fusión que comprende dicha molécula de ácido nucleico.[0009] Se abarcan también los vectores o casetes de expresión que comprenden moléculas de ácido nucleico de la invención. Asimismo, quedan abarcadas células, plantas o semillas que comprenden los vectores de la invención.[0010] La presente invención se refiere también a plantas transgénicas que expresan una molécula de ácido nucleico y/o péptido de la invención. Las plantas transgénicas pueden expresar el transgen según cualquiera de los modos conocidos en la especialidad, incluyendo pero sin limitarse sólo a ellos, expresión constitutiva, expresión regulada en el desarrollo, expresión específica de tejido, etc. Las semillas obtenidas a partir de una planta transgénica de la invención también quedan abarcadas.

Se proporcionan los métodos de producción de los péptidos de la invención y/o polipéptidos que comprenden uno

o más péptidos de la invención, v.g., por medios recombinantes. También quedan abarcadas composiciones que comprenden uno o más péptidos de la invención y/o polipéptidos que comprenden uno o más péptidos de la invención. [0012] La presente invención proporciona también métodos para insertar dirigidamente un polipéptido en un plastidio en una planta por unión de un péptido de tránsito de plastidio de la invención con el polipéptido que se va a insertar dirigidamente. En algunos modos de realización, el método comprende la unión por recombinación de una primera molécula de ácido nucleico que codifica un péptido de tránsito de plastidio de la invención con una segunda molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que se va a insertar dirigidamente de manera que la traducción de la molécula de ácido nucleico produce un polipéptido de fusión.

Los métodos para identificar nuevos péptidos de tránsito de plastidio quedan abarcados dentro de la presente invención que comprende i) introducir en una planta o célula vegetal un vector que comprende una primera molécula de ácido nucleico que codifica un péptido de tránsito de plastidio candidato unida una segunda molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que está solamente activo en un plastidio de manera que la traducción de la primera y la segunda molécula de ácido nucleico produce una proteína de fusión y ii) la detección selectiva de la actividad del polipéptido, indicando dicha actividad que el polipéptido está localizado en un plastidio y el péptido de tránsito de plastidio candidato es funcional.

Definiciones [0013] Un “péptido de tránsito de plastidio” se refiere a una secuencia de aminoácidos que media la inserción dirigida o localización de una secuencia de aminoácidos a la que se une (v.g., como polipéptido de fusión) en un plastidio.[0014] Un “plastidio” se refiere a un organelo de membrana doble pequeño de células vegetales y ciertos protistos que contiene ribosomas, ADN y a menudo pigmento. Los plastidios pueden darse en una forma no diferenciada (proplastidio) y en varias formas diferenciadas, incluyendo, pero sin limitarse sólo a ellas cloroplastos, etioplastos, amiloplastos, cromoplastos, elaioplastos y leucoplastos.[0015] Los términos “molécula de ácido nucleico” o “polinucleótido” se refieren a desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos, tanto en forma de hebra simple como de doble hebra. A no ser que se limite específicamente, el término abarca moléculas de ácido nucleico que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen propiedades de unión similares a los nucleótidos de referencia y se metabolizan de manera similar en nucleótidos naturales. [0016] Los términos “polipéptido”, “péptido” y “proteína” se refieren a un polímero de radicales de aminoácido. Los términos se aplican a polímeros de aminoácido que contienen radicales de aminoácido naturales, así como polímeros de aminoácido en los que uno o más...

1. Un péptido de tránsito de plastidio aislado seleccionado entre:

(a) un péptido que comprende cualquiera entre SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO:46.

(b) un péptido que es idéntico al menos en un 95% a la secuencia de aminoácidos de cualquiera entre SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO:46.

(c) un péptido que está codificado por una molécula de ácido nucleico que se hibrida con una sonda de ácido nucleico que consiste en la secuencia de nucleótidos de cualquiera de las moléculas de ácido nucleico que codifica cualquiera entre SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO:46, o un complemento del mismo después de al menos un lavado en 0,2X SSC a 55ºC durante 20 minutos;

(d) un fragmento que comprende al menos un 90% de los radicales de aminoácido consecutivos de cualquiera entre SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO:46.

2. Un polipéptido de fusión que comprende el péptido de la reivindicación 1.

3. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un péptido de tránsito de plastidio y que se selecciona entre:

(a) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido que codifica cualquiera entre SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO:46.

(b) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido que es idéntica al menos en un 95% a cualquiera de las moléculas de ácido nucleico que codifica

cualquiera entre SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO:46.

(c) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido que codifica un péptido que es idéntico al menos en un 95% a la secuencia de aminoácido de cualquiera entre SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO:46; o un complemento de la misma.

(D) Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótido que se hibrida con una sonda de ácido nucleico que consiste en la secuencia de nucleótido de cualquiera de las moléculas de ácido nucleico que codifica cualquiera entre SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO:46, o un complemento de la misma seguido de al menos un lavado en 0,2 X SSC a 55ºC durante 20 minutos; y

(e) un fragmento que comprende al menos un 90% de los nucleótidos consecutivos de una molécula de ácido nucleico que codifica cualquiera entre SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO:46, o un complemento de la misma.

4. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido de fusión que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 3.

5. Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 3.

6. Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 4.

7. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 5.

8. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 6.

9. Una planta transgénica que comprende un transgen que expresa:

(a) un polipéptido que comprende un péptido según la reivindicación 1;

(b) una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 3;

(c) un polipéptido de fusión según la reivindicación 2; o

(d) una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 4.

10. La planta transgénica de la reivindicación 9, seleccionándose la planta entre maíz, soja, tomate, patata, algodón, girasol, alfalfa, lechuga y tabaco.

11. Un método para insertar dirigidamente un polipéptido en un plastidio en una planta que comprende la introducción en la planta de un vector que comprende una primera molécula de ácido nucleico que codifica un péptido de tránsito de plastidio unida a una segunda molécula de ácido nucleico que codifica dicho polipéptido de manera que la traducción de la primera y la segunda molécula de ácido nucleico produce una proteína de fusión, seleccionándose dicho péptido de transferencia de plastidio entre SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO:46.

12. El método de la reivindicación 11, en el que el péptido de tránsito de plastidio es N-terminal para el polipéptido en la proteína de fusión.

13. El método de la reivindicación 11, en el que el polipéptido se selecciona entre proteínas de toxina Bt, EPSP

sintasa, GAT, ALS y enzimas que modifican un proceso fisiológico que tiene lugar en un plastidio.

14. El método de la reivindicación 13, en el que el proceso fisiológico es fotosíntesis, síntesis de ácido graso, síntesis de aminoácido, síntesis de aceite, síntesis de carotenoide, síntesis de terpenoide y síntesis de almidón.

15. El método de la reivindicación 11, en el que el polipéptido se aísla de los plastidios de la planta.

16. El método para insertar dirigidamente un polipéptido en un plastidio en una planta que comprende la introducción en la planta de un vector que comprende una primera molécula de ácido nucleico que codifica un péptido de tránsito de plastidio unida a una segunda molécula de ácido nucleico que codifica dicho polipéptido de manera que la traducción de la primera y segunda molécula de ácido nucleico produce una proteína de fusión, seleccionándose dicho péptido de transferencia de plastidio entre los péptidos de la reivindicación 1.

17. El método de la reivindicación 16, en el que el péptido de tránsito de plastidio está N-terminal del polipéptido en la proteína de fusión.

18. El método de la reivindicación 16, en el que el polipéptido se selecciona entre proteínas de toxina Bt, EPSP sintasa, GAT, ALS y enzimas que modifican un proceso fisiológico que tiene lugar en un plastidio.