PARVOVIRUS DOTADO DE UN GENOMA ENRIQUECIDO EN CpG ÚTIL PARA EL TRATAMIENTO DEL CÁNCER.

Un parvovirus caracterizado por un genoma enriquecido con motivo CpG,

en el cual el genoma contiene al menos motivos CpG adicionales que no se encuentran presentes en el genoma en estado natural

La presente invención se refiere a un parvovirus caracterizado por un genoma enriquecido con CpG, en que el genoma contiene por lo menos dos motivos CpG adicionales que no se encuentran presentes en el genoma en estado natural. La presente invención también se refiere a la utilización de dicho parvovirus para el tratamiento contra el cáncer. 5

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Los virus oncolíticos como los parvovirus de roedores representan nuevas herramientas en el tratamiento contra el cáncer. Además de destruir de forma específica las células cancerígenas (oncólisis), estos agentes también proporcionan señales de peligro, induciendo al sistema inmunitario a eliminar tumores infectados por virus. Como consecuencia de los eventos oncolíticos, los sistemas inmunitarios innato y adaptativo consiguen acceder a los antigenes del tumor, lo cual tiene como resultado unos efectos de iniciación cruzada y vacunación. Los parvovirus de 10 roedores son virus con ADN de hebra simple que poseen actividad oncolítica “intrínseca”, es decir, que preferentemente se replican en, y destruyen células cancerígenas tanto de origen murino como humano (1). A pesar de ello, la eficacia anti-cáncer de los candidatos más prometedores para aplicaciones clínicas en seres humanos (incluyendo el H-1PV) requiere alguna mejora.

Por lo tanto, el objeto de la presente invención es proporcionar parvovirus mejorados para usos terapéuticos. 15

De acuerdo con la invención, ello se consigue a través de los aspectos que se definen en las reivindicaciones. La presente invención se basa en los descubrimientos del solicitante en el sentido que pueden generarse virus oncolíticos mejorados combinando las características beneficiosas de la oncólisis y la vacunación. Se diseñó un vector de parvovirus oncolítico con motivos CpG extra en su genoma, lo cual provocó que se acumulasen de forma selectiva en células tumorales a través de la amplificación del genoma vírico, es decir, derivados de H-1PV que contenían motivos 20 CpG fueron preparados y comparados con los virus parentales en relación con su capacidad para mejorar la eficacia de una vacuna anti-tumor autóloga en un modelo preestablecido de metástasis de pulmón de hepatoma de rata (2). Se prepararon dos variantes de H-1PV enriquecidas con CpG (JabCG1 y JabCG2), preservando tanto la competencia de replicación como las características oncolíticas del virus parental. Los virus fueron inoculados ex vivo en la vacuna antes de su inyección subcutánea en animales que presentaban tumores. Estas son condiciones en las que el H-1PV deja de 25 tener un efecto oncolítico directo significativo en las metástasis, y actúa esencialmente como un adyuvante, modulando el grado de efectividad de la vacuna para provocar una respuesta de inmunidad anti-tumor (3). En concordancia con su contenido aumentado de CpG, los genomas JabCG1 y JabCG2 demostraron ser unos activadores in vitro más potentes de señales mediadas por TLR-9 que el ADN de H-1PV en estado natural. La actividad antitumoral fue evaluada en un modelo de metástasis de pulmón por hepatoma MH3924A de rata, en que los virus parentales y modificados fueron 30 inoculados ex vivo como adyuvantes de una vacuna autóloga administrada de forma subcutánea. En esta configuración, que excluye los efectos oncolíticos directos sobre las metástasis, el vector JabCG2 mostró una mejora en la inmunogeneicidad, induciendo a los marcadores de inmunidad celular (IFN-) y de activación de células dendríticas (CD80, CD86) en ganglios linfáticos mediastínicos (drenado de tumor). Ello tuvo como consecuencia un índice metastático significativamente menor (50%) en comparación con otros programas de vacunación (células tratadas con 35 H-1 PV, JabCG1, JabGC o de control). Los motivos CpG pueden añadirse al genoma H-1PV sin alterar la capacidad del virus de replicar y lisar las células tumorales. Y lo que es todavía más interesante, la adición de motivos CpG puede mejorar la capacidad de los parvovirus, por ejemplo, el H-1PV, de convertir las células tumorales infectadas en una vacuna que provoque estimulación inmunitaria y supresión de metástasis en condiciones en que el virus en estado natural tiene un efecto limitado. Esta es la primera demostración de que la oncosupresión inducida por virus puede 40 mejorarse modificando el número de motivos CpG activadores en el genoma del virus, lo cual tiene como resultado la inmunoestimulación in vivo.

En resumen, los datos presentes proporcionan una evidencia de que aumentar el número de motivos CpG inmunoestimulatorios en los virus oncolíticos hace que resulte posible mejorar su efecto anti-cáncer global a través de la inducción de vacunación antitumor. El hecho que los parvovirus se repliquen de forma selectiva en las células 45 neoplásticas debería limitar la amplificación de motivos CpG a la zona del tumor, minimizando de esta manera el riesgo de efectos colaterales.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Construcción y propiedades in vitro de los virus modificados con CpG

(A). Secuencias de fragmentos que contienen CpG (con motivos CpG en negrita) clonados en el sitio Hpal del vector 50 pSR19. La organización del genoma de H-1PV se representa de forma esquemática con las ubicaciones de la cápsida (VP1/2), las proteínas no estructurales (NS1/2) los genes y sus promotores respectivos (P4, P38). También se indican las posiciones de las zonas de restricción de Hpall y Acll. Las secuencias enmarcadas en JabCG1 representan los motivos que unen los PIF.

(B). Análisis de tipo Southern blot del ADN viral extraído de las células NBK 48 horas después de la infección (a una 55 multiplcidad de 1 unidad de replicación por célula) sirviendo como referencia los diferentes virus de CpG (JabCG1, JabCG2, JabGC) o H-1PV en estado natural. Se indican las posiciones del ADN viral de una sola hebra (ss), y las formas de replicación del monómero (mRF) y el dímero (dRF).

(C). Supervivencia de las células medida utilizando el ensayo MTT y expresada en porcentaje de células vivas en cultivos tratados con virus en relación con cultivos de control. Las células de NBK (inyectadas en una placa de cultivo de 96 cavidades a 2 x 103 células / cultivo) fueron analizadas 72 horas después de la inoculación de virus modificados con H-1PV o CpG en las multiplicidades de infección indicadas (MOI). Los valores indicados son el promedio de las mediciones realizadas por cuadruplicado. 5

(D). Estado de metilación del ADN viral extraído de células de NBK 48 horas después de la infección (MOI 1), tanto con JabCG2 como con H-1PV. Después de la purificación, el ADN viral fue sometido (o no) a tratamiento con las enzimas de restricción indicadas. La presencia de las formas replicativas virales y los cambios en su tamaño después de la digestión están indicados con flechas. Los resultados son representativos de tres experimentos.

Figura 2: Activación de macrófagos y células HEKTLR9 dependiente de TLR9 por ADN de H-1PV en estado natural y 10 modificado.

(A). Emisión de NO de macrófagos RAW 264.7. Las células (1 x 105 células por cultivo en una placa de cultivo de 96 cavidades) fueron preactivadas el día anterior con IFN- recombinante (10 U / ml) antes de la estimulación con los oligonucleótidos indicados (CpG28, PTOCG1, PTOCG2 y PTOGC) (5g / ml) or ADN ss viral (JabCG1, JabCG2, JabGC, H-1PV) (5g / ml); se utilizó ADN de E. Coli en la misma concentración como control positivo. Se incluyeron 15 células RAW tratadas con medio (MED) suplementado (o no) con IFN- o Lipofectamina como controles negativos. Los niveles de NO se determinaron a las 18 horas utilizando la reacción Greiss. Algunas de las muestras de ADN ss fueron preincubadas con LipofectaminaTM 2000 (Lip; 1g / cavidad) antes de su aplicación sobre las células. El ADN ss absorbido por las células de RAW264.7 fue detectado por el PCR 18 horas después del tratamiento utilizando una serie de iniciadores común tanto para el genoma modificado con H-1PV como para el modificado con CpG. 20

(B). Señalización dependiente de TLR9 en las células tratadas con ADN viral. Las células HEK que expresaban de forma estable mTLR9 y que contenían un gen indicador de luciferasa activado por NFxB fueron inyectadas en placas de cultivo de 96 cavidades (2 x 103 células por cavidad) y estimuladas con los ADN ss indicados (JabCG1, JabCG2, JabCG, 10g / ml). El tratamiento con oligonucleótidos cGpCODN-1826 y sCpGODN-1826 (5g / ml) sirvió...

1. Un parvovirus caracterizado por un genoma enriquecido con motivo CpG, en el cual el genoma contiene al menos motivos CpG adicionales que no se encuentran presentes en el genoma en estado natural.

2. El parvovirus de la reivindicación nº1, que contiene al menos 5 motivos CpG adicionales que no se encuentran presentes en el genoma en estado natural. 5

3. El parvovirus de las reivindicaciones nº1 o 2, que contiene entre 5 y 20 motivos CpG adicionales que no se encuentran presentes en el genoma en estado natural.

4. El parvovirus de cualquiera de las reivindicaciones nº1 a 3, en que dichos motivos CpG adicionales son generados mediante la utilización de codones alternativos.

5. El parvovirus de cualquiera de las reivindicaciones nº1 a 3, en que dichos motivos CpG adicionales están insertados 10 en un intrón o una región 3‟ no traducida de un gen.

6. El parvovirus de la reivindicación nº5, en que dicha región 3‟ no traducida es la región no traducida en el extremo 3‟ de una unidad de transcripción VP.

7. El parvovirus de cualquiera de las reivindicaciones nº1 a 6, en que dicho motivo CpG comprende la secuencia nucleótida AACGTTT o GTCGTT. 15

8. El parvovirus de cualquiera de las reivindicaciones nº1 a 7, en que dicho parvovirus es el parvovirus H1 (H-1PV) o un parvovirus de roedor relacionado.

9. El parvovirus de la reivindicación nº8, en que dicho parvovirus de roedor relacionado es Lulll, el virus diminuto del ratón (MMV), el parvovirus del ratón (MPV), el virus diminuto de la rata (RMV), el parvovirus de la rata (RPV) o el virus de la rata (RV). 20

10. El parvovirus de cualquiera de las reivindicaciones nº1 a 9, en que dicho parvovirus contiene tres motivos AACGTT y tres motivos GTCGTT dentro de la región no traducida en el extremo 3‟ de la unidad de transcripción de VP.

11. El parvovirus de la reivindicación nº10, que contiene la secuencia nucleótida 5‟-GTT AAC GTT TAC AGC TGA CTA GTC GTT TGC TCAG TCT AAC GTT CTT GTCT ATT GTC GTT TAC TAG TCT CTT AAC GTT TCAT CTA CTT GTC GTT AAC-3‟ dentro de la región no traducida en el extremo 3‟ de la unidad de transcripción de VP. 25

12. Una composición farmacéutica que contiene un parvovirus según cualquiera de las reivindicaciones nº 1 a 11 o una célula que produce dicho parvovirus.

13. Utilización de un parvovirus según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o una célula que produce dicho parvovirus para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer.

14. La utilización de la reivindicación nº 13, en que dicho cáncer es un hepatoma, un linfoma o un carcinoma de 30 páncreas.