NUEVOS SUBSTRATOS CROMÓGENOS PARA LA DETECCIÓN DE HIDROLASAS.

Procedimiento de detección de una actividad enzimática peptidasa,

caracterizado por el hecho de que consiste en: - poner por lo menos un substrato constituido por lo menos por dos moléculas, una primera molécula constituida por una parte marcador no cromógena asociada a por lo menos una parte específica diana de la enzima, encontrándose constituida, la citada parte marcadora no cromógena, por aminobenceno ó uno de sus derivados, **Fórmula** y una segunda molécula constituida por una parte marcador, no cromógena, constituida por α-naftol o uno de sus derivados, **Fórmula** en presencia de por lo menos un tipo de microorganismos, tales como las bacterias contenidas en una muestra a someter a test de ensayo, sin la adición de oxidasa - esperar que las bacterias hidrolicen el (los) substrato(s), y - detectar la formación de un complejo coloreado, a partir del acoplamiento oxidante de dos partes marcador, correspondiendo, el citado complejo coloreado, a la molécula **Fórmula** Fórmulas éstas en las cuales: · el radial R1, se encuentra constituido por OH, SH, ó N(X)(Z), en donde, X y / ó Z, se eligen de entre H, CH3, CH2CH3, N(CH3)2; N(CH2CH2OH)2, y **Fórmula** · el radical R10, se elige entre -H, Br, Cl, I, y los grupos de átomos tales como SH, que pueden retirarse durante el acoplamiento oxidante · y cada radical R2 a R9, R11 y R12, se elige entre H, OH, Br, Cl, e I, CH3, CH2CH3, OCH3, OCH2CH3 y COOH

La presente invención, se refiere a la evidenciación de enzimas del tipo peptidasas, para la utilización de substratos cromógenos eficaces. La presente invención, se refiere igualmente a un procedimiento y a un dispositivo de identificación de micro-organismos que son, a la vez, simples y fiables.

Desde hace muchos años, se utilizan substratos particulares para permitir la determinación de la presencia o de la ausencia de actividades enzimáticas características de las bacterias. Para la elección de los substratos, según haya reacción o no, es posible el caracterizar la naturaleza de una clase de bacterias o de diferenciarla de las especies de una clase bacteriana dada.

Los substratos sintéticos de enzimas, se encuentran constituidos por dos partes, una primera parte específica de la actividad enzimática a revelar, y una segunda parte que hace la función de marcador, a la cual se la denominará, en la parte que sigue de este documento, como parte marcador.

Estos substratos particulares, pueden ser substratos fluorescentes o cromógenos. De hecho, es la segunda parte o parte marcador que es fluorescente o cromógena, cuando ésta no se encuentra asociada a la primera parte.

Los substratos fluorescentes, pueden ser de diferentes composiciones.

En primer lugar, los substratos a base de umbeliferona o de aminocumarina y sus derivados sustituidos en la posición 2, los cuales permiten la liberación de un compuesto fluorescente de color variante, del azul al verde, bajo lámpara a ultravioletas (UV)(λex = 365 nm).

A continuación, los substratos a base resorufina (y derivados), en donde existe liberación de un compuesto fluorescente rosa, bajo luz natural (λex = 530 nm).

Finalmente, los substratos a base de fluoresceína (y derivados), la cual, después de degradación, libera un compuesto fluorescente amarillo9, bajo la luz natural )(λex = 485 nm).

Estos substratos, están poco adaptados a una utilización en medios gelosados (gelificados), y son más útiles en medio líquido.

Los substratos cromógenos, pueden igualmente ser de diferentes naturalezas.

En primer lugar, existen los substratos a base de indoxil y sus derivados, los cuales, en presencia de oxígeno, producen un precipitado variante del azul al rosa.

Sus aplicaciones, se encuentran esencialmente limitadas a las osidasas, esterasas, y no conciernen a la detección de una actividad peptidasa. Bien adaptadas a una utilización sobre soporte sólido (filtro, gelosa, gel de electroforesis,...), estos se encuentran, en cambio, menos bien adaptados a una utilización en medio acuoso líquido (formación de un precipitado).

En segundo lugar, existen substratos a base de hidroxiquinolina o de esculetina y sus derivados, los cuales, en presencia de sales de hierro, producen un precipitado marrón.

También, otra vez, sus aplicaciones, se encuentran limitadas a las osidasas y esterasas. Éstos se encuentran adaptados a una utilización sobre soporte sólido, y poco adaptadas a una utilización en medio acuoso líquido.

En tercer lugar, existen substratos a base de nitrofenol y nitroanilina y derivados, en donde se obtienen la formación de un compuesto amarillo.

Éstos permiten detectar las actividades osidasas y esterasas en el caso de substratos a base de nitrofenol, y actividades peptidasas, en el caso de substratos a base de nitroanilina. Mientras tanto, en el caso de la detección de actividades peptidasas, la nitroanilina liberada, es tóxica para las bacterias que se desea identificar o caracterizar, lo cual puede ser perjudicial para los análisis en curso o ulteriores. Por otra parte, éstos están poco adaptados a una utilización sobre soporte sólido y, mejor adaptados a una utilización en medio líquido. Además, éstos son poco cromógenos, debido al coeficiente de extinción relativamente débil del color (amarillo), en donde, el contraste, es poco pronunciado en los medios biológicos.

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En cuarto lugar, existen substratos a base de naftol y naftilamina y sus derivados. En este caso, la reacción, se efectúa en dos tiempos, el naftol o naftilamina liberada mediante la actividad enzimática, sigue un efecto “azocoupling” (azo-acoplamiento), en presencia de una sal de diazonio que se ajusta en el momento de la revelación, conduciendo a la formación de un compuesto insoluble coloreado.

Éstos permiten detectar las actividades osidasas y esterasas mediante la intermediación del naftol, y las actividades peptidasas mediante la intermediación de la naftilamina. La reacción “azo-coupling”, se efectúa en un medio que es a menudo químicamente agresivo, tóxico para las bacterias y que convierte a la muestra en inutilizable para otros análisis y, además, las naftilaminas, son cancerígenas.

Para revelar la naftilamina y, por lo tanto, una actividad peptidasa, es también posible el añadir, al final de la reacción enzimática, p-dimetilaminocinamaldehído en medio ácido, en lugar de una sal de diazonio, siempre con los inconvenientes de toxicidad con respecto a la muestra analizada.

La solicitud de patente francesa FR – A – 2 708 286, propone utilizar una mezcla de substratos cromógenos, proporcionando, cada cromógeno, una coloración particular para una enzima específica, que es diferente de la coloración y de la enzima asociada al otro cromógeno. Cuando las dos coloraciones y, por lo tanto, las dos enzimas, se encuentran presentes, existe formación de una “tercio-coloración”.

Esta técnica, no es de todos modos satisfactoria, debido al hecho de que, en función de la reducida concentración de una de las dos enzimas, no es posible detectar esta actividad enzimática la cual se encuentra entonces enmascarada mediante la coloración asociada a la enzima, cuya concentración es preponderante.

Finalmente, las solicitudes de patentes estadounidenses US – A – 4.681.841 y US – A – 4.588.836, describen un procedimiento indirecto de detección de una sola actividad enzimática, que utiliza un acoplamiento entre un aminobenceno y un derivado aromático hidroxilado (por ejemplo, el alfa-naftol), acoplamiento éste, el cual engendra la formación de un indicador cromógeno, en presencia de oxidasa. Uno de los dos compuestos (el aminobenceno), entra en la composición del substrato de partida: si la actividad enzimática investigada se encuentra presente, este compuesto, se liberará y podrá reaccionar con el otro compuesto.

No obstante, la presencia de oxidasa, en el medio reactivo, para que sea posible la evidenciación de la enzima buscada, es una absoluta necesidad. No obstante, si bien es cierto que estas informaciones disuaden a la persona experta en el arte especializado de la técnica, de buscar una solución en la que no se utilice oxidasa, el solicitante, por mediación de numerosos tests de ensayo efectuados en estos laboratorios, a probado qu4e es posible el evidenciar la enzima buscada, mediante la utilización de, por ejemplo, del amino-benceno y del α-benceno, sin la adición de oxidasa.

Es por lo tanto fácil de comprender, el hecho de que no existe hoy en día, un substrato no cromógeno, que permita revelar por lo menos dos actividades enzimáticas que sea particularmente eficaz e interesante.

En cuanto a lo concerniente al procedimiento y el dispositivo de identificación, el estado actual de la técnica, se encuentra constituido por un procedimiento de identificación que permite una manipulación en tres etapas:

- extracción de la colonia a identificar

- realización de un test de ensayo de orientación, e

- investigación de colonias parecidas a las observadas y realización de un inóculo.

El test de ensayo de orientación, debe practicarse antes de la utilización de un sistema de identificación.

Éste es particularmente el caso, para la coloración Gram que necesita una observación microscópica.

Mientras tanto, esta coloración, no siempre es fácil de realizar y, sobre todo, de interpretar. Por otra parte, el coste que acarrea este test de ensayo queda lejos de no tenerse en consideración.

Uno de los objetivos de la presente invención, es por lo tanto el crear el lazo de unión entre un medio de cultivo y los sistemas de identificación y de antibiograma, ofreciendo, a los biólogos, la posibilidad de... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de detección de una actividad enzimática peptidasa, caracterizado por el hecho de que consiste en:

- poner por lo menos un substrato constituido por lo menos por dos moléculas, . una primera molécula constituida por una parte marcador no cromógena asociada a por lo menos una parte específica diana de la enzima, encontrándose constituida, la citada parte marcadora no cromógena, por aminobenceno ó uno de sus derivados,

**(Ver fórmula)**

. y una segunda molécula constituida por una parte marcador, no cromógena, constituida por α-naftol o uno de sus derivados,

**(Ver fórmula)**

en presencia de por lo menos un tipo de microorganismos, tales como las bacterias contenidas en una muestra a someter a test de ensayo, sin la adición de oxidasa

10 - esperar que las bacterias hidrolicen el (los) substrato(s), y

- detectar la formación de un complejo coloreado, a partir del acoplamiento oxidante de dos partes marcador, correspondiendo, el citado complejo coloreado, a la molécula

**(Ver fórmula)**

Fórmulas éstas en las cuales:

· el radial R1, se encuentra constituido por OH, SH, ó N(X)(Z), en donde, X y / ó Z, se eligen de entre H, CH3, CH2CH3, N(CH3)2; N(CH2CH2OH)2, y

**(Ver fórmula)**

· el radical R10, se elige entre -H, Br, Cl, I, y los grupos de átomos tales como SH, que pueden retirarse durante el acoplamiento oxidante

· y cada radical R2 a R9, R11 y R12, se elige entre H, OH, Br, Cl, e I, CH3, CH2CH3, OCH3, OCH2CH3 y COOH.

2. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que, las citadas moléculas, se encuentran presentes en un material absorbente, y éstas se ponen en contacto con la muestra, y porque, después de la detección, los microorganismos de esta forma extraídos, se vuelven a poner en suspensión, para permitir análisis ulteriores (identificación, antibiogramas, etc.).

3. Procedimiento, según la reivindicación 2, caracterizado por el hecho de que, las citadas moléculas, se encuentran asociadas a un oxidante.

4. Procedimiento, según la reivindicación 3, caracterizado por el hecho de que, el oxidante, es el ferricianato de potasio.

5. Procedimiento, según una las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por el hecho de que, éste, comprende un activador de la reacción, tal como una reducida cantidad de la primera molécula y / o de la segunda molécula, presente(s) en la muestra a someter a test de ensayo.

6. Procedimiento, según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por el hecho de que, la composición, comprende un ligante, tal como la polivinilpirrolidona (PVP).

7. Procedimiento, según una de las reivindicaciones 1 a 6, para identificar el Gram de una especie bacteriana a someter a test de ensayo, caracterizado por el hecho de que, la primera molécula, se encuentra constituida por el αnaftol.

8. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en combinación con la reivindicación 7, caracterizado por el hecho de que, la composición del material absorbente, es la siguiente:

- α-naftol de 0,01 a 5 g/l, de una forma preferente, de 0,1 a 1 g/l, y por ejemplo, de 0,5 g/l,

- ferricianato de potasio de 0,01 g a 5 g/l, de una forma preferente, de 0,1 a 1 g/l, y por ejemplo, de 0,5 g/l, y

- AlaDMpPD de 0,01 a 5 g/l, de una forma preferente, de 0,1 a 1 g/l y, por ejemplo, de 0,5 g/l.

9. Procedimiento, según la reivindicación 5, caracterizado por el hecho de que, el activador, se encuentra constituido por AlaDMpPD, en una concentración de 0,01 a 0,5 g/l, de una forma preferente, de 0,05 a 0,1 1 g/l y, por ejemplo, de 0,075 g/l.

10. Procedimiento, según la reivindicación 6, caracterizado por el hecho de que, la composición, comprende, además, de 1 a 50 g/l, de una forma preferible, de 10 a 25 g/l y, por ejemplo, 15 g/l de PVP.