NUEVOS GENES QUE CODIFICAN NUEVAS ENZIMAS PROTEOLÍTICAS.

La invención se refiere a secuencias polinucleotídicas nuevamente identificadas que comprenden genes que codifican nuevas proteasas aisladas de Aspergillus niger. La invención se refiere a la secuencia nucleotídica de longitud completa de los nuevos genes, a las secuencias de ADNc que comprenden las secuencias codificantes de longitud completa de las nuevas proteasas, así como a las secuencias de aminoácidos de las proteínas funcionales de longitud completa y fragmentos y variantes de las mismas. La invención también se refiere a métodos para usar estas enzimas en procesos industriales, y a métodos para diagnosticar infecciones fúngicas. También se incluyen en la invención células transformadas con un polinucleótido según la invención, y células en las que una proteasa según la invención se modifica genéticamente para potenciar o reducir su actividad y/o nivel de expresión. Antecedentes de la invención Enzimas proteolíticas Las proteínas se pueden considerar heteropolímeros que consisten en bloques constructores de aminoácidos conectados mediante un enlace peptídico. La unidad repetitiva en las proteínas es el átomo de carbono alfa central con un grupo amino y un grupo carboxilo. Excepto para la glicina, una denominada cadena lateral de aminoácidos sustituye uno de los dos átomos de hidrógeno del carbono alfa que quedan. La cadena lateral de aminoácidos hace asimétrico al carbono alfa central. En general, en las proteínas se encuentra el enantiómero L del aminoácido. Los siguientes términos describen los diversos tipos de aminoácidos polimerizados. Péptidos son cadenas cortas de restos de aminoácidos con una secuencia definida. Aunque realmente no hay un máximo al número de restos, el término indica habitualmente una cadena cuyas propiedades están determinadas principalmente por su composición de aminoácidos y que no tiene una conformación tridimensional fija. El término polipéptido se usa habitualmente para las cadenas más largas, habitualmente de secuencia y longitud definidas, y en principio de la longitud apropiada para plegarse en una estructura tridimensional. Proteína se reserva para polipéptidos que aparecen de forma natural y que muestran una estructura tridimensional definida. En el caso en el que la función principal de las proteínas sea catalizar una reacción química, habitualmente se denomina una enzima. Las proteasas son las enzimas que catalizan la hidrólisis del enlace peptídico en (poli)péptidos y proteínas. En condiciones fisiológicas, las proteasas catalizan la hidrólisis del enlace peptídico. La Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (1984) ha recomendado usar el término peptidasa para el conjunto de hidrolasas del enlace peptídico (Subclase E.C 3.4.). Los términos proteasa y hidrolasa peptídica son sinónimos de peptidasa, y también se pueden usar aquí. Las proteasas comprenden dos clases de enzimas: las endopeptidasas y las exopeptidasas, que escinden enlaces peptídicos en puntos dentro de la proteína, y eliminan aminoácidos secuencialmente del término N o C respectivamente. Proteinasa se usa como sinónimo de endopeptidasa. El enlace peptídico se puede producir en el contexto de di-, tri-, tetrapéptidos, péptidos, polipéptidos o proteínas. En general, la composición de aminoácidos de péptidos y polipéptidos naturales comprende 20 aminoácidos diferentes, que muestran la configuración L (excepto para la glicina, que no tiene ningún centro quiral). Sin embargo, la actividad proteolítica de las proteasas no está limitada a péptidos que contienen sólo los 20 aminoácidos naturales. También se pueden escindir enlaces peptídicos entre los denominados aminoácidos no naturales, así como enlaces peptídicos entre aminoácidos modificados o análogos de aminoácidos. Algunas proteasas no aceptan los enantiómeros D de los aminoácidos en ciertas posiciones. En general, la notable estereoselectividad de las proteasas las hacen muy útiles en el proceso de la resolución química. Muchas proteasas muestran actividades secundarias interesantes, tales como actividad de esterasa, actividad de tiol esterasa y actividad de (des)amidasa. Estas actividades secundarias habitualmente no se limitan a aminoácidos solamente, y pueden ser muy útiles en bioconversiones en el área de productos químicos finos. Hay un número de razones por las cuales las proteasas de hongos filamentosos, microorganismos eucariotas, son de particular interés. El proceso básico de escisión hidrolítica de enlaces peptídicos en las proteínas parece costosa y potencialmente perjudicial para un organismo si no se controla apropiadamente. Los límites deseados a la acción proteolítica se logran a través de la especificidad de proteinasas, mediante compartimentalización de proteasas y sustratos en la célula, a través de la modificación de los sustratos que permiten el reconocimiento por las proteasas respectivas, mediante regulación vía activación de cimógenos, y la presencia o ausencia de inhibidores específicos, así como a través de la regulación de la expresión génica de proteasas. En hongos, las proteasas también están implicadas en otros procesos celulares fundamentales, incluyendo el recambio proteico intracelular, el procesamiento, la translocación, la esporulación, la germinación y la diferenciación. De hecho, Aspergillus nidulans y Neurospora crassa se han usado como organismos modelo para analizar la base molecular de un abanico de procesos fisiológicos y de desarrollo. Su genética permite el acceso directo a estudios bioquímicos y genéticos, en condiciones de nutrientes y de cultivo definidas. Además, se ha aislado un gran grupo de hongos patógenos para seres humanos, ganado y cosechas, y se ha sugerido que la proteolisis desempeña un papel en su patogenicidad (penetración del hospedante, mecanismos de defensa del hospedante opuestos y/o nutrición durante la infección). Las proteasas también se usan frecuentemente en procesos de laboratorio, clínicos e industriales; las proteasas 2   tanto microbianas como no microbianas se usan ampliamente en la industria alimentaria (cocción, elaboración de cerveza, fabricación de quesos, ablandamiento de la carne), en la industria del curtido, y en la fabricación de detergentes biológicos (Aunstrup, 1980). El interés comercial a la hora de explotar ciertos hongos filamentosos, especialmente los Aspergilli, como hospedantes para la producción de proteínas tanto homólogas como heterólogas también ha renovado recientemente los intereses en las proteasas fúngicas (van Brunt, 1986ab). Las proteasas provocan a menudo problemas en la expresión heteróloga y en la sobreexpresión homóloga de proteínas en hongos. En particular, la expresión heteróloga está impedida por la degradación proteolítica de los productos expresados por proteasas homólogas. Estos intereses comerciales han dado como resultado estudios detallados de espectros proteolíticos y construcción de cepas deficientes en proteasas, y han mejorado el conocimiento sobre la expresión y regulación de las proteasas en estos organismos. En consecuencia, existe una gran necesidad de identificar y eliminar nuevas proteasas en hongos filamentosos. Los microorganismos tales como, por ejemplo, hongos son particularmente útiles en la producción a gran escala de proteínas. En particular, cuando tales proteínas se segregan al medio. Las enzimas proteolíticas desempeñan un papel en estos procesos de producción. Por otro lado, en general se necesitan enzimas proteolíticas particulares para el procesamiento apropiado de la proteína diana y el bienestar metabólico del hospedante de la producción. Por otro lado, la degradación proteolítica puede disminuir significativamente el rendimiento de las proteínas segregadas. Un mal plegamiento en la ruta de secreción puede conducir a la degradación mediante proteasas intracelulares. Esto puede ser un problema particular a la hora de producir proteínas heterólogas. Los detalles de los procesos proteolíticos, que son responsables de la degradación de las proteínas que se desvían del proceso secretor en hongos, no se conocen exactamente. En eucariotas, la degradación de las proteínas celulares se logra mediante un proteasoma, y habitualmente implica el marcado con ubiquitina de las proteínas a degradar. En hongos, las proteasas proteasómicas y vaculares son también candidatos probables para la degradación proteolítica de proteínas secretoras malamente plegadas. La degradación proteolítica es probablemente citoplásmica, pero no se pueden excluir proteasas residentes en el retículo endoplásmico. Desde el punto de vista de la mejora de la cepa del hospedante de producción, el sistema proteolítico puede ser una diana interesante para la manipulación genética y mejora de la cepa de producción. Copias adicionales de genes... [Seguir leyendo]

1. Un polinucleótido aislado hibridable en condiciones muy restrictivas a polinucleótido SEC ID NO: 10 o a la secuencia SEC ID NO: 67, en el que dicho polinucleótido codifica una proteína que tiene actividad de proteasa. 2. Un polinucleótido aislado según la reivindicación 1, obtenible de un hongo filamentoso. 3. Un polinucleótido aislado según la reivindicación 2, obtenible de A. niger. 4. Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos según SEC ID NO: 124 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% homóloga a la secuencia de aminoácidos según SEC ID NO: 124, y que tiene actividad de proteasa. 5. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia nucleotídica según SEC ID NO: 10 o la secuencia SEC ID NO: 67. 6. Un polinucleótido aislado según la secuencia SEC ID NO: 10 o la secuencia SEC ID NO: 67. 7. Un vector que comprende una secuencia polinucleotídica según las reivindicaciones 1 a 6. 8. Un vector según la reivindicación 7, en el que dicha secuencia polinucleotídica según las reivindicaciones 1 a 6 está ligada operativamente con secuencias reguladoras adecuadas para la expresión de dicha secuencia polinucleotídica en una célula hospedante adecuada. 9. Un vector según la reivindicación 8, en el que dicha célula hospedante adecuada es un hongo filamentoso. 10. Un método para fabricar un polinucleótido según las reivindicaciones 1 a 6 o un vector según las reivindicaciones 7 a 9, que comprende las etapas de cultivas una célula hospedante transformada con dicho polinucleótido o dicho vector, y aislar dicho polinucleótido o dicho vector de dicha célula hospedante. 11. Un polipéptido aislado según la secuencia SEC ID NO: 124 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% homóloga a la secuencia de aminoácidos según SEC ID NO: 124, y que tiene actividad de proteasa. 12. Un polipéptido aislado según la reivindicación 11, obtenible de Aspergillus niger. 13. Un polipéptido aislado obtenible expresando un polinucleótido según las reivindicaciones 1 a 6 o un vector según las reivindicaciones 7 a 9 en una célula hospedante apropiada, preferiblemente Aspergillus niger. 14. Un método para fabricar un polipéptido según las reivindicaciones 11 a 13, que comprende las etapas de transformar una célula hospedante adecuada con un polinucleótido aislado según las reivindicaciones 1 a 6 o un vector según las reivindicaciones 7 a 9, cultivar dicha célula en condiciones que permitan la expresión de dicho polinucleótido, y opcionalmente purificar el polipéptido codificado de dicha célula o medio de cultivo. 15. Una célula hospedante recombinante que comprende un polinucleótido según las reivindicaciones 1 a 6 o un vector según las reivindicaciones 7 a 9. 16. Una célula hospedante recombinante que expresa un polipéptido según las reivindicaciones 11 a 13. 17. Una célula hospedante recombinante según las reivindicaciones 15 ó 16, en la que dicha célula hospedante procede de una especie Aspergillus, preferiblemente A. niger. 18. Proteína de fusión que comprende una secuencia polipeptídica según las reivindicaciones 11 a 13. 344