Una mezcla de enzimas aisladas y purificadas que consiste en a) una dipeptidil peptidasa IV (DPP IV) aislada y purificada que comprende SEQ ID NO:

35, o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a SEQ ID NO: 35 y b) una aminopeptidasa aislada y purificada procedente de un dermatofito seleccionado del grupo que consiste en Epidermophyton floccosum, Microsporum audouinii, Microsporum ferrugineum, Trichophyton concentricum, Trichophyton kanei, Trichophyton megninii, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton raubitschekii, Trichophyton rubrum, Trichophyton schoenleinii, Trichophyton soudanense, Trichophyton tonsurans, Trichophyton violaceum, Trichophyton yaoundei, Microsporum canis, Microsporum equinum, Microsporum nanum, Microsporum persicolor, Trichophyton equinum, Trichophyton simii, Trichophyton verrucosum, Microsporum gypseum, Trichophyton ajelloi y Trichophyton terrestre, que comprende la forma madura de una secuencia de aminoácidos que comprende bien i) una leucina aminopeptidasa (LAP) aislada y purificada que comprende SEQ ID NO: 3, o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a SEQ ID NO: 3; o ii) una leucina aminopeptidasa (LAP) aislada y purificada que comprende SEQ ID NO: 6, o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a SEQ ID NO: 6.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente descripción se refiere a nuevos polipéptidos y a los ácidos nucleicos que los codifican, que tienen propiedades catalíticas únicas. Más particularmente, la descripción se refiere a ácidos nucleicos que codifican nueva leucina aminopeptidasa (LAP) y otros polipéptidos amino y carboxi-peptidasas, que se referirán en la presente memoria colectivamente como EXOX, así como a vectores, células anfitrionas, anticuerpos y métodos recombinantes para producir estos ácidos nucleicos y polipéptidos. Estos genes se han identificado en dos especies fúngicas diferentes, Trichophyton rubrum y Aspergillus fumigatus.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las bacterias, levaduras y hongos filamentosos, así como las células especializadas de las plantas, invertebrados y vertebrados, expresan proteínas de membrana útiles para el transporte de aminoácidos, dipéptidos y tripéptidos. Lubkowitz et al., Microbiology 143:387-396 (1997); Hauser et al., Mol. Membr. Biol. 18(1):105-112 (2001); Stacey et al., Trends Plant Sci. 7(6):257-263 (2002); Rubio-Aliaga y Daniel, Trends Pharmacol. Sci. 23(9):434-440 (2002). En levaduras, hongos filamentosos y plantas también se conocen transportadores que también aceptan oligopéptidos grandes (4-5 restos de aminoácidos). La digestión de proteínas en aminoácidos se ha investigado en microorganismos usados en la industria de fermentación de alimentos. Las bacterias del género Lactobacillus (O'Cuinn et al., Biochem. Soc. Trans. 27(4):730-734 (1999)) y los hongos del género Aspergillus (Doumas et al., Appl. Environ. Microbiol. 64:4809-4815 (1998)) secretan endoproteasas y exoproteasas, que cooperan muy eficazmente en la digestión de proteínas.

La actividad aminopeptidasa, que también puede jugar un papel en el desarrollo de los hongos durante la infección, se ha detectado en el micelio y el sobrenadante del cultivo de una especie de hongos (De Bersaques y Dockx, Arch. Belg. Dermatol. Syphiligr. 29:135-140 (1973); Danew y Friedrich, Mykosen 23:502-511 (1980)), sin embargo, hasta el momento no se ha aislado ni caracterizado ninguna aminopeptidasa o carboxipeptidasa de dermatofitos.

La descripción se basa en parte en el descubrimiento de polipéptidos aislados que contienen la forma madura de una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33 y 35. La descripción también proporciona polipéptidos aislados que contienen una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs. 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33 y 35, así como polipéptidos aislados que son al menos 90% idénticos a los polipéptidos que tienen estas secuencias, en el que el polipéptido opcionalmente tiene actividad aminopeptidasa o carboxipeptidasa. Por ejemplo, el polipéptido puede ser una leucina aminopeptidasa tal como ruLAP2.

También se proporcionan polipéptidos aislados que tienen una o más sustituciones de aminoácidos conservativas. Dichos polipéptidos pueden poseer actividad aminopeptidasa.

La descripción también engloba polipéptidos que son variantes alélicas naturales de la secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33 y 35. Estas variantes alélicas incluyen secuencias de aminoácidos que son las traducciones de secuencias de ácido nucleico que se diferencian en uno o más nucleótidos de las secuencias de ácido nucleico seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33 y 35. El polipéptido variante en el que cualquier aminoácido cambiado en la secuencia elegida se cambia para proporcionar una sustitución conservativa.

También se describe un método para eliminar aminoácidos particulares de péptidos, por ejemplo etiquetas de proteínas recombinantes, en el que el polipéptido activo que elimina el aminoácido es un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33 y 35, o un fragmento biológicamente activo de éste.

Cualquiera de los polipéptidos puede ser natural. Además, cualquiera de estos polipéptidos puede estar en una composición que incluye un vehículo, y la composición puede estar en un kit que incluye uno o más contenedores.

También se proporcionan dermatofitos que contienen los polipéptidos. Por ejemplo, los dermatofitos adecuados incluyen Epidermophyton floccosum, Microsporum audouinii, Microsporum ferrugineum, Trichophyton concentricum, Trichophyton kanei, Trichophyton megninii, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton raubitschekii, Trichophyton rubrum, Trichophyton schoenleinii, Trichophyton soudanense, Trichophyton tonsurans, Trichophyton violaceum, Trichophyton yaoundei, Microsporum canis, Microsporum equinum, Microsporum nanum, Microsporum persicolor, Trichophyton equinum, Trichophyton simii, Trichophyton verrucosum, Microsporum gypseum, Trichophyton ajelloi y Trichophyton terrestre.

También se describen sobrenadantes de cultivo microbiano que contienen los polipéptidos de la invención.

La descripción también se refiere al uso de terapéuticos en la fabricación de un medicamento para tratar un síndrome asociado con una enfermedad humana, en el que el terapéutico incluye los polipéptidos descritos y la enfermedad se selecciona de una patología asociada con estos polipéptidos.

La descripción también se refiere a métodos para degradar un sustrato polipeptídico. Dichos métodos incluyen poner en contacto el sustrato polipeptídico con uno o más de los polipéptidos, que se han aislado. Por ejemplo, el sustrato polipeptídico puede ser una proteína de longitud completa. Además, el uno o más polipéptidos aislados pueden usarse para digerir secuencialmente el sustrato polipeptídico. El sustrato polipeptídico puede seleccionarse de caseína desnaturalizada, gliadina, gluten, albúmina de suero bovino o fragmentos de éstos. Por ejemplo, el polipéptido aislado puede ser una aminopeptidasa, que puede ser una leucina aminopeptidasa tal como ruLAP2.

La descripción también se refiere a métodos para identificar un agente terapéutico potencial para usarse en el tratamiento de infecciones fúngicas, en el que la infección fúngica está relacionada con la expresión aberrante o interacciones fisiológicas aberrantes de los polipéptidos de la invención. Dichos métodos incluyen proporcionar una célula que expresa el polipéptido y que tiene una propiedad o función atribuible al polipéptido, poner en contacto la célula con una composición que comprende una sustancia candidata, y determinar si la sustancia altera la propiedad

o función atribuible al polipéptido. Si no se observa ninguna alteración en presencia de la sustancia cuando la célula se pone en contacto con una composición en ausencia de la sustancia, la sustancia se identifica como agente terapéutico potencial. Por ejemplo, la propiedad o función atribuible al polipéptido puede ser actividad aminopeptidasa o carboxipeptidasa.

La descripción también se refiere a métodos para tratar un estado patológico en un mamífero por la administración de un polipéptido al mamífero en una cantidad que es suficiente para aliviar el estado patológico. Típicamente, el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33 y 35, o un fragmento biológicamente activo de éste. El estado patológico que se va a tratar incluye una infección fúngica, enfermedad celíaca, mala absorción en el tracto digestivo, esprúe, una reacción alérgica y una deficiencia enzimática. Por ejemplo, la reacción alérgica puede ser una reacción al gluten.

Además se describen métodos para tratar un estado patológico en un mamífero por la administración de un inhibidor de proteasa al mamífero en una cantidad que es suficiente para aliviar el estado patológico. El inhibidor de proteasa incluye una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33 y 35, o un fragmento biológicamente activo de éste. Por ejemplo, el estado patológico puede ser una infección fúngica.

La descripción se refiere además a polipéptidos aislados que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs: 3, 6, 9,... [Seguir leyendo]

1. Una mezcla de enzimas aisladas y purificadas que consiste en

a) una dipeptidil peptidasa IV (DPP IV) aislada y purificada que comprende SEQ ID NO: 35, o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a SEQ ID NO: 35 y

b) una aminopeptidasa aislada y purificada procedente de un dermatofito seleccionado del grupo que consiste en Epidermophyton floccosum, Microsporum audouinii, Microsporum ferrugineum, Trichophyton concentricum, Trichophyton kanei, Trichophyton megninii, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton raubitschekii, Trichophyton rubrum, Trichophyton schoenleinii, Trichophyton soudanense, Trichophyton tonsurans, Trichophyton violaceum, Trichophyton yaoundei, Microsporum canis, Microsporum equinum, Microsporum nanum, Microsporum persicolor, Trichophyton equinum, Trichophyton simii, Trichophyton verrucosum, Microsporum gypseum, Trichophyton ajelloi y Trichophyton terrestre, que comprende la forma madura de una secuencia de aminoácidos que comprende bien

i) una leucina aminopeptidasa (LAP) aislada y purificada que comprende SEQ ID NO: 3, o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a SEQ ID NO: 3; o

ii) una leucina aminopeptidasa (LAP) aislada y purificada que comprende SEQ ID NO: 6, o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a SEQ ID NO: 6.

2. La mezcla de enzimas aisladas y purificadas de la reivindicación 1, que comprende la aminopeptidasa de (i) y la aminopeptidasa de (ii).

3. La mezcla de enzimas aisladas y purificadas de las reivindicaciones 1 ó 2, en la que DPPIV comprende una secuencia de aminoácidos que comprende sustituciones de aminoácidos conservativas de menos de 5% de los restos de aminoácidos de SEQ ID NO: 35.

4. La mezcla de enzimas aisladas y purificadas de las reivindicaciones 1-3, en la que la leucina aminopeptidasa de

(i) o (ii) comprende una secuencia de aminoácidos que comprende sustituciones de aminoácidos conservativas de menos de 5% de los restos de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o SEQ D NO: 6.

5. La mezcla de enzimas aisladas y purificadas de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además una o más proteasas.

6. La mezcla de enzimas aisladas y purificadas de la reivindicación 5, en la que dicha una o más proteasas se seleccionan del grupo que consiste en tripsina, pronasa, quimiotripsina y proteinasaK.

7. La mezcla de enzimas aisladas y purificadas de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizada porque la leucina aminopeptidasa (LAP) es ruLAP2 que consiste en SEQ ID NO: 3.

8. La mezcla de enzimas aisladas y purificadas de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, para usarse en la degradación, hidrólisis o maduración de sustratos polipeptídicos o proteínas.

9. Un kit que comprende, en uno o más contenedores, la mezcla de enzimas aisladas y purificadas de cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

10. Uso de la mezcla de enzimas aisladas y purificadas de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la hidrólisis de proteínas, para la degradación de subproductos, proteínas tóxicas o contaminantes; para la degradación de priones

o virus; para la degradación de proteínas para proteómica; para la degradación de sustrato cornificado; para la hidrólisis de polipéptidos para análisis de aminoácidos; para cosmetología tal como herramientas de peeling, depilación dermoabrasión y dermoplanning; para la limpieza y/o preparación de prótesis; para suavizantes textiles; para jabones; para la limpieza o desinfección de tanques sépticos o cualquier contenedor que contiene proteínas que deben eliminarse o esterilizarse; y para la limpieza de instrumentos quirúrgicos.

11. Uso de la mezcla de enzimas aisladas y purificadas de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la fabricación de un medicamento para la limpieza de heridas, para la cicatrización de heridas o para tratar un síndrome asociado con una enfermedad humana, seleccionándose dicha enfermedad del grupo que consiste en enfermedad celíaca, mala absorción del tracto digestivo, una reacción alérgica, una deficiencia enzimática, una infección fúngica, micosis y esprúe.

12. El uso de la mezcla de enzimas aisladas y purificadas según la reivindicación 11, caracterizado porque la reacción alérgica es una reacción al gluten o a fragmentos de éste.

13. Un método in vitro para degradar un sustrato polipeptídico, comprendiendo el método poner el sustrato polipeptídico en contacto con la mezcla de enzimas aisladas y purificadas de cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

14. El método de la reivindicación 13, caracterizado porque dicha mezcla de enzimas aisladas y purificadas digiere secuencialmente un sustrato polipeptídico de longitud completa o una proteína de longitud completa.

15. El método de cualquiera de las reivindicaciones 13 ó 14, caracterizado porque el sustrato polipeptídico se selecciona del grupo que consiste en caseína, gliadina, gluten, albúmina de suero bovino o fragmentos de éstas.

5 16. El método de cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, caracterizado porque la longitud del sustrato polipeptídico es de 2 a 200 aminoácidos.

17. Un método in vitro para eliminar aminoácidos del extremo amino de una proteína, que comprende poner dicha proteína en contacto con la mezcla de enzimas aisladas y purificadas de cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

18. El método de la reivindicación 17, caracterizado porque el extremo amino de dicha proteína comprende una 10 etiqueta His.

Figura 1 Figura 2 Figura 3

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Figura 4; Determinación de la actividad AMPP de T. rubrum a diferentes pH usando Lys(Abz)-Pro- Pro-pNA como sustrato.

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Figura 6: Digestión de gliadina 14mer sin (A) y con (B) ruLAP1 durante 4h a 370C con una proporción E/S de 1/50 (p:p).

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Figura 7: Digestión de gliadina 14mer durante 4h con ruDPPIV sola a una proporción E/S de 1/25 (p:p) (A) y con una mezcla de ruLAP1 y DPPIV a la misma proporción de 1/50 (p:p) (B).

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Figura 8: Digestión de gliadina 33mer sin (A) y con (B) ruDPPIV durante 4h a 370C con una proporción E/S de 1/50 (p:p).

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Figura 9: Digestión de gliadina 33mer a 370C durante 4h con una mezcla de ruLAP1 y ruDPPIV a una proporción E/S de 1/50 (p:p) cada una.

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Figura 10: Espectro de masas de Gly-Ser-pro-NPY (masa molecular calculada a 8.203,12 Da) antes (A) y después de digestión (B) con ruLAP1, lo que resulta en la escisión de Gly-Ser (-144,1 Da)

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Figura 12: Espectro de masas de (A) TG47 (masa molecular calculada de 18.894,9 uma) y del producto de digestión con ruLAP1 (B), lo que resulta en la eliminación de la metionina N-terminal.

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Figura 13: Caracterización por ESI-MS del producto de digestión de desMet-G-CSF sin (A)

o con (B) ruDPPIV.