NUEVAS ESTRATEGIAS DE MARCAJE PARA LA DETECCIÓN SENSIBLE DE ANALITOS.

Un método para detectar un analito, seleccionado de ácidos nucleicos,

en una muestra, que comprende las etapas: (i) proporcionar una muestra; (ii) poner en contacto la muestra con un compuesto funcionalizado que comprende al menos un grupo funcional seleccionado de grupos alquino y azida que es una primera pareja de reacción para una reacción de Click, siendo dicha reacción de Click una reacción de cicloadición (3 + 2) entre los grupos azida y alquino que forma un anillo de 1,2,3triazol, y en el que el grupo funcional está unido a una nucleobase de un compuesto nucleosídico o nucleotídico o un oligómero o polímero del mismo, en condiciones en las que dicho compuesto forma un producto de asociación con el analito a detectar, o su complemento, (iii) poner en contacto el producto de asociación con una segunda pareja de reacción para dicha reacción de Click, que comprende el grupo azida o alquino complementario, en condiciones en las que se produce una reacción de Click entre la pareja de reacción primera y segunda, en el que la segunda pareja de reacción comprende además un grupo marcador o un grupo precursor del marcador, (iv) si es necesario, convertir los grupos precursores del marcador en grupos marcadores, y (v) detectar dichos grupos marcadores

La presente invención se refiere a métodos y al uso de reactivos para detectar analitos, por ejemplo ácidos nucleicos. Los nuevos métodos y reactivos permiten una detección simple y sensible, incluso en muestras biológicas complejas.

Antecedentes de la Invención

El análisis rápido de material genético en busca de secuencias diana específicas, por ejemplo para determinar la presencia de polimorfismos de un solo nucleótido, la presencia de un cierto gen, por ejemplo un gen de resistencia, o de 10 ARNm, requiere nuevas herramientas fáciles de usar, eficaces y fiables. El principal problema es la necesidad de detectar el ADN o ARN de interés directamente en pequeñas muestras biológicas, tales como sangre del paciente o plantas. Estos proporcionan el analito sólo en cantidades minúsculas. A fin de alcanzar la sensibilidad requerida, habitualmente se requiere una etapa de amplificación, en la que el analito de ácido nucleico se amplifica antes del análisis, o se usa un método de detección, en el que se amplifica la señal minúscula de detección, directamente 15 obtenida del analito de ADN/ARN.

Los métodos para la amplificación del analito de ácido nucleico incluyen PCR y otros protocolos de amplificación de ácidos nucleicos. La amplificación mediante PCR tiene la ventaja principal de que, dentro de un conjunto de diferentes hebras de ADN obtenidas del material biológico, sólo se amplifica la secuencia de ADN de interés. Esto es la base para el análisis fiable de genes individuales en muestras biológicas complejas. Sin embargo, la amplificación mediante PCR 20 requiere etapas complejas de procedimiento que, en algunos casos, son demasiado inconvenientes y caras. La amplificación de la señal de detección se puede lograr uniendo una enzima, tal como peroxidasa de rábano picante, al analito, que convierte continuamente un sustrato dado en un producto coloreado.

Otra manera de amplificar la señal de detección es la metalización de ADN. Una única partícula metálica unida a ADN/ARN (el núcleo) cataliza la deposición de cada vez más metal, que cataliza la deposición adicional de metal [1-9]. 25 La señal inducida por la deposición metálica crece en consecuencia de manera exponencial. La deposición metálica se puede detectar eléctricamente, si el analito se coloca entre los electrodos, u ópticamente (por ejemplo, con el ojo), debido a que el metal depositado da lugar a una mancha negra, por ejemplo sobre papel, en gel, o en el tubo de ensayo. En principio, la deposición metálica es el método de detección más sensible debido a que un pequeño agrupamiento metálico (núcleo) es suficiente para comenzar la reacción. Sin embargo, en la práctica, la sensibilidad del 30 método está limitada por la nucleación metálica no específica, por ejemplo a través de impurezas en vecindad espacial próxima al analito, por ejemplo en los electrodos, en el gel, o en el papel que tiene el analito. De hecho, la deposición metálica no específica es la razón principal por la que la tinción de ADN con plata no se usa de forma habitual en analítica de oligonucleótidos. La tinción con plata es complicada además por el hecho de que el ADN es incapaz de construir él mismo el núcleo de iniciación. Requiere una modificación previa. El método de elección actualmente es la 35 reacción de ADN con glutaraldehído, que se une covalentemente al ADN mediante unión inespecífica de la secuencia a grupos amina primaria en la nucleobase [7]. Este aducto, si se trata con una sal de plata, reduce la Ag+ de la sal a plata atómica, que, mientras está unida al ADN, funciona como el núcleo requerido. El tratamiento posterior del ADN nucleado con sales de plata y agentes reductores inicia la deposición metálica exponencial. Otra posibilidad es intercambiar los contraiones en la hebra de ADN por Ag+, que se reduce subsiguientemente para dar sitios de nucleación de Ag0. La 40 principal desventaja es que el glutaraldehído también reacciona con impurezas u otras especies químicas próximas al analito, lo que nuevamente induce la deposición no específica de plata.

Los agrupamientos metálicos tales como Au, partículas de Pd o complejos de Pt unidos a ADN también funcionan como sitios de nucleación para la deposición posterior de metal hasta la construcción de hilos conductores [1-9]. Aquí, los agrupamientos se unen a grupos reactivos que forman un enlace covalente con ADN, o unidades que sólo se intercalan 45 o unen de otro modo a ADN/ARN. Todos estos métodos marcan todo el ADN en una muestra biológica, y por lo tanto no permiten el marcaje específico de una secuencia y por tanto el análisis específico de una secuencia de un ADN diana, tal como un único gen en una muestra biológica compleja.

En [8] se describe la preparación de dominios de ADN marcados mediante una incorporación, mediada por telomerasas, de trifosfatos de nucleósidos modificados con amina en una repetición telomérica modificada iniciada por cebadores. 50 Los telómeros que contienen aminas se funcionalizan con ésteres N-succinimidílicos de nanopartículas de oro activadas, para producir hebras de ADN con nanopartículas de oro. El alargamiento de estos sitios de nanopartículas por deposición metálica posterior a lo largo del ADN produce de hecho un crecimiento rápido de los agrupamientos metálicos hasta la construcción de nanohilos moleculares templados de ADN. Sin embargo, la eficacia de la incorporación del trifosfato modificado con aminas en el extremo telomérico que crece es baja, y requiere el dopaje del 55 trifosfato, lo que da como resultado una distribución de los sitios de nucleación. De este modo, el procedimiento no permite el marcaje específico de secuencias.

También se ha intentado recientemente el marcaje de ADN específico de sitios vía un método litográfico complejo [4]. Según este método, se efectúa una protección parcial de las moléculas de ADN mediante la unión de RecA. Las secuencias de ADN desprotegidas se tratan entonces con glutaraldehído, que marca estas secuencias para la 60 metalización. La reducción específica del sitio de iones de plata por las funciones aldehído unidas a ADN da como resultado la formación de un hilo a lo largo de estas regiones. Sin embargo, no es posible un marcaje específico de secuencias de moléculas de ácido nucleico en una muestra biológica compleja.

H. C. Kolb et al. (H. C. Kolb, “The growing impact of click chemistry on drug discovery”, Drug Discovery Today, vol. 8, nº 24, 15 de diciembre de 2003, páginas 1128-1137) muestra, en la página 1135, en el esquema 4c, un cebador de 5 secuenciación directo universal que tiene unido un grupo funcional de Click. En este caso, sin embargo, el grupo funcional de Click se une mediante un ligador al grupo fosfato en el extremo 5' del cebador, mientras que, según la presente invención, el grupo funcional de Click se une a una nucleobase. La diferencia es obvia cuando se tiene en cuenta la descripción de T. S. Seo et al. (T. S. Seo et al., “Click chemistry to construct fluorescent oligonucleotides for DNA sequencing”,

J. Org

Aunque estos documentos demuestran el interés en nuevas estrategias de marcaje de ADN, los procedimientos complicados implicados a fin de lograr el marcado evitan que estos sistemas se usen para cualquier aplicación real. En particular, estos métodos son incapaces de marcar selectivamente secuencias de ADN o ARN de interés directamente en una muestra biológica bruta.

De este modo, fue un objeto de la presente invención proporcionar nuevos métodos y reactivos que permitan una 20 detección simple, eficaz y específica de analitos, particularmente de ácidos nucleicos en muestras biológicas complejas.

Sumario de la Invención

La presente invención se refiere a métodos y kits de reactivos para detectar un analito, por ejemplo un ácido nucleico en una muestra, que implican el uso de un compuesto funcionalizado mediante Click que forma un producto de asociación con el analito a detectar. La introducción...

1. Un método para detectar un analito, seleccionado de ácidos nucleicos, en una muestra, que comprende las etapas:

(i) proporcionar una muestra;

(ii) poner en contacto la muestra con un compuesto funcionalizado que comprende al menos un grupo funcional 5 seleccionado de grupos alquino y azida que es una primera pareja de reacción para una reacción de Click, siendo dicha reacción de Click una reacción de cicloadición (3 + 2) entre los grupos azida y alquino que forma un anillo de 1,2,3-triazol, y en el que el grupo funcional está unido a una nucleobase de un compuesto nucleosídico o nucleotídico o un oligómero o polímero del mismo, en condiciones en las que dicho compuesto forma un producto de asociación con el analito a detectar, o su complemento, 10

(iii) poner en contacto el producto de asociación con una segunda pareja de reacción para dicha reacción de Click, que comprende el grupo azida o alquino complementario, en condiciones en las que se produce una reacción de Click entre la pareja de reacción primera y segunda, en el que la segunda pareja de reacción comprende además un grupo marcador o un grupo precursor del marcador,

(iv) si es necesario, convertir los grupos precursores del marcador en grupos marcadores, y 15

(v) detectar dichos grupos marcadores.

2. El método de la reivindicación 1, que comprende una detección cualitativa.

3. El método de las reivindicaciones 1 ó 2, que comprende una detección cuantitativa.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el analito a detectar es un ácido nucleico seleccionado de ADN y ARN. 20

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la muestra es una muestra biológica.

6. El método de la reivindicación 5, en el que la muestra es una muestra agrícola o nutricional.

7. El método de la reivindicación en el que la muestra es una muestra clínica.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la detección se lleva a cabo directamente sin amplificación. 25

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la detección se lleva a cabo en combinación con una etapa de amplificación.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que se lleva a cabo una detección de un analito de ácido nucleico específica de una secuencia.

11. El método de la reivindicación 10, en el que la formación de dicho producto de asociación comprende una reacción 30 de hibridación específica de una secuencia.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que la nucleobase se selecciona de bases purínicas y pirimidínicas de origen natural y de origen no natural.

13. El método de la reivindicación 12, en el que el grupo funcional está unido a la posición 5 y 6, preferiblemente posición 5, de una nucleobase de pirimidina, o a las posiciones 7 y 8, preferiblemente posición 7, de una nucleobase de 35 purina.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el grupo funcional está unido al compuesto vía un enlace directo o un espaciador.

15. El método de la reivindicación 14, en el que dicho espaciador es un espaciador flexible, o un espaciador al menos parcialmente rígido. 40

16. El método de la reivindicación 15, en el que el espaciador comprende al menos un grupo seleccionado de grupos alqueno, grupos alquino, grupos cíclicos, particularmente grupos aromáticos y heteroaromáticos, y sus combinaciones.

17. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que dicho compuesto funcionalizado se selecciona de:

(i) un bloque constructor de ácido nucleico o de análogo de ácido nucleico funcionalizado, y/o 45

(ii) un ácido nucleico o análogo de ácido nucleico funcionalizado.

18. El método de la reivindicación 17, en el que la formación de dicho producto de asociación comprende incorporar dicho bloque constructor funcionalizado en una molécula de ácido nucleico o de análogo de ácido nucleico.

19. El método de la reivindicación 18, en el que dicho nucleótido o análogo nucleotídico funcionalizado se incorpora enzimáticamente en una molécula de ácido nucleico. 5

20. El método de la reivindicación 18, en el que la formación de dicho producto de asociación comprende unir dicho ácido nucleico o análogo de ácido nucleico funcionalizado al analito a detectar.

21. El método de la reivindicación 20, en el que la unión comprende la hibridación a un analito de ácido nucleico.

22. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 17-21, que comprende una reacción de extensión de cebador, opcionalmente en combinación con una reacción de amplificación de ácido nucleico. 10

23. El método de la reivindicación 22, que comprende:

proporcionar al menos una molécula de cebador que se hibrida, en las condiciones de ensayo, con el analito de ácido nucleico a detectar, o su complemento, y

extender dicho cebador,

en el que se incorpora en el producto de extensión al menos un nucleótido o análogo nucleotídico funcionalizado. 15

24. El método de la reivindicación 22 ó 23, que comprende:

proporcionar al menos una molécula de cebador funcionalizada, que se hibrida, en las condiciones de ensayo, con el analito de ácido nucleico a detectar, o su complemento,

extender dicha molécula de cebador,

en el que se forma una molécula de cebador extendida. 20

25. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 21-24, que comprende:

proporcionar una sonda de hibridación funcionalizada, que se hibrida, en las condiciones de ensayo, con el analito de ácido nucleico a detectar, o su complemento,

en el que se forma un producto de hibridación.

26. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 19-25, que comprende: 25

proporcionar una sonda de hibridación funcionalizada, que se hibrida, en las condiciones de ensayo, con el analito de ácido nucleico a detectar, o su complemento, y

someter el producto de hibridación a un tratamiento en el que se disuelve un producto de hibridación que contiene al menos un desemparejamiento, en el que la presencia de un producto de hibridación sin disolver indica la presencia y/o cantidad de un ácido nucleico que tiene una secuencia completamente complementaria a la sonda de hibridación. 30

27. El método de la reivindicación 26, en el que el tratamiento comprende un tratamiento de digestión de los desemparejamientos.

28. El método de la reivindicación 27, en el que el tratamiento de digestión de los desemparejamientos comprende poner en contacto el producto de hibridación con una glucosilasa de desemparejamiento.

29. El método de la reivindicación 26, en el que el tratamiento comprende un tratamiento de hibridación difererencial. 35

30. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, en el que la detección se lleva a cabo por medios ópticos.

31. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, en el que la detección se lleva a cabo por medios eléctricos.

32. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31, que comprende una detección paralela de una 40 pluralidad de ácidos nucleicos.

33. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 32, en el que la detección se lleva a cabo sobre una superficie sólida, por ejemplo sobre un chip de una micromatriz.

34. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33, en el que el grupo funcional se selecciona de grupos azida o grupos alquino.

35. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34, en el que la segunda pareja de reacción comprende un grupo marcador seleccionado de grupos marcadores ópticamente detectables, particularmente grupos marcadores de fluorescencia, o de grupos marcadores activos para una redox. 5

36. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 35, en el que la segunda pareja de reacción comprende un grupo precursor del marcador, seleccionado de grupos aldehído y grupos aldehído protegidos, y grupos precursores de aldehído.

37. El método de la reivindicación 36, en el que la conversión de los grupos precursores de marcadores en grupos marcadores comprende formar deposiciones metálicas alrededor de los grupos aldehído. 10

38. Un kit de reactivo para detectar un analito en una muestra, que comprende:

(a) un compuesto funcionalizado que comprende

(i) al menos un grupo funcional de Click, seleccionado de grupos alquino y azida, que es una primera pareja de reacción para una reacción de Click, siendo dicha reacción de Click una reacción de cicloadición (3 + 2) entre grupos azida y alquino que forma un anillo de 1,2,3-triazol, y 15

(ii) un bloque constructor de un ácido nucleico o de un análogo de ácido nucleico, en el que el grupo funcional está unido a una nucleobase,

(b) una segunda pareja de reacción para dicha reacción de Click, que comprende el grupo azida o alquino complementario, en el que la segunda pareja de reacción comprende además un grupo marcador o un grupo precursor de marcador, y 20

(c) opcionalmente un reactivo formador de marcador, capaz de convertir los grupos precursores de marcadores en grupos marcadores.

39. Uso de un kit de reactivo de la reivindicación 38 en un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 37.

40. Uso de un compuesto de fórmula (II):

C-S-N 25

en la que

C es un grupo funcional de Click seleccionado de grupos alquino y azida que es una primera pareja de reacción para una reacción de Click, siendo dicha reacción de Click una reacción de cicloadición (3 + 2) entre grupos azida y alquino que forma un anillo de 1,2,3-triazol,

S es un espaciador, y 30

N es un bloque constructor de ácido nucleico o de un análogo de ácido nucleico, tal como un compuesto nucleosídico o nucleotídico, en el que el grupo funcional de Click se une a una nucleobase,

en un método para detectar un analito de ácido nucleico en una muestra,

en el que el compuesto de fórmula (II) forma un producto de asociación con el analito a detectar.

41. El uso de la reivindicación 40, en el que el compuesto de fórmula (II) se hace reaccionar con una pareja de reacción 35 que comprende grupos marcadores o grupos precursores de marcadores.

42. El uso de la reivindicación 40 ó 41, en el que la nucleobase se selecciona de bases purínicas y pirimidínicas de origen natural y de origen no natural.

43. El uso de la reivindicación 42, en el que la nucleobase se selecciona de adenina, 7-desazaadenina, guanina, 7-desazaguanina, citosina, timidina, uracilo, inosina y xantina. 40

44. El uso de las reivindicaciones 42 ó 43, en el que el grupo funcional se une a las posiciones 5 y 6, preferiblemente a la posición 5, de una nucleobase pirimidínica, o a las posiciones 7 y 8, preferiblemente a la posición 7, de una nucleobase purínica.

45. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 41 a 44, en el que dicho espaciador es un espaciador al menos parcialmente rígido. 45

46. El uso de la reivindicación 45, en el que el espaciador comprende al menos un grupo seleccionado de grupos alqueno, grupos alquino, grupos cíclicos, particularmente grupos aromáticos y heteroaromáticos, y sus combinaciones.

47. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 41 a 46, en el que el compuesto es un bloque constructor para la síntesis química o enzimática de ácidos nucleicos o análogos de ácidos nucleicos o un precursor de los mismos.

48. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 41 a 47, en el que el compuesto es un trifosfato de nucleósido, 5 particularmente un trifosfato de nucleósido de ribosa, de 2'-desoxirribosa o de 2',3'-didesoxirribosa, o un fosforamidito, H-fosfonato o fosforotriésteres de nucleósido.

49. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 41 a 48, en el que el compuesto es un bloque constructor para la síntesis de ácidos nucleicos peptídicos, ácidos nucleicos morfolínicos, o ácidos nucleicos bloqueados.

50. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 41 a 49, en el que el grupo funcional está unido a la nucleobase vía 10 un espaciador que tiene una longitud de cadena de hasta 10 átomos.

51. El uso de la reivindicación 50, en el que la longitud de cadena es de hasta 3 átomos.

52. Una molécula de ácido nucleico o de un análogo de ácido nucleico, que tiene incorporada en ella al menos un compuesto de fórmula (II) como se define según una cualquiera de las reivindicaciones 40 a 51, en la que el grupo funcional es un grupo alquino unido a las posiciones 5 y 6, preferiblemente a la posición 5, de una nucleobase 15 pirimidínica, o a las posiciones 7 y 8, preferiblemente a la posición 7, de una nucleobase purínica, y en la que la molécula de ácido nucleico o de un análogo de ácido nucleico es capaz de hibridarse con un ácido nucleico complementario.

53. La molécula de ácido nucleico o de un análogo de ácido nucleico de la reivindicación 52, que es un ácido nucleico seleccionado de ADN y ARN, o una molécula de un análogo de ácido nucleico seleccionada de ácidos nucleicos 20 peptídicos, ácidos nucleicos morfolínicos o ácidos nucleicos bloqueados.

54. Un método para sintetizar una molécula de ácido nucleico o de un análogo de ácido nucleico que es capaz de hibridarse con un ácido nucleico complementario, que comprende incorporar un bloque constructor de nucleótido o de un análogo de nucleótido que comprende un compuesto (II) de una cualquiera de las reivindicaciones 40 a 51, en el que el grupo funcional es un grupo alquino unido a las posiciones 5 y 6, preferiblemente a la posición 5, de una nucleobase 25 de pirimidina, o a las posiciones 7 y 8, preferiblemente posición 7, de una nucleobase de purina, en una molécula de ácido nucleico o de un análogo de ácido nucleico.

55. El método de la reivindicación 54, que comprende una síntesis química y/o una síntesis enzimática.

56. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 54 a 55, que comprende además poner en contacto la molécula de ácido nucleico o de un análogo de ácido nucleico con una segunda pareja de reacción del compuesto (II), y llevar a 30 cabo una reacción de Click entre las parejas de reacción primera y segunda, siendo dicha reacción de Click una reacción de cicloadición (3 + 2) entre grupos azida y alquino que forma un anillo de 1,2,3-triazol.

57. Un producto de asociación molécula de ácido nucleico o de un análogo de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 52 a 53 con un analito.

58. El producto de la reivindicación 57, que es un producto de hibridación con un ácido nucleico complementario. 35

59. Uso del método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 37 o del kit de reactivo de la reivindicación 38, para aplicaciones agrícolas.

60. El uso de la reivindicación 59, para detectar ácidos nucleicos de plantas, patógenos vegetales o plagas de plantas tales como insectos.

61. El uso de las reivindicaciones 59 ó 60, para detectar variabilidades genéticas, por ejemplo SNP en plantas, 40 patógenos vegetales o plagas de plantas.

62. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 59 a 61, para detectar o monitorizar resistencias, tolerancias o intolerancias a herbicidas, fungicidas o plaguicidas, por ejemplo resistencias, tolerancias o intolerancias a plaguicidas en hongos, insectos o plantas.

63. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 59 a 62, para genotipar, por ejemplo para detectar y/o diferenciar 45 especies o cepas de hongos, insectos, o plantas.

64. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 59 a 63, para detectar y/o diferenciar organismos o cepas genéticamente modificados, por ejemplo organismos o cepas de hongos, insectos o plantas.

65. Uso del método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 37 o del kit de reactivo de la reivindicación 38, para aplicaciones de diagnóstico y forenses. 50

66. El uso de la reivindicación 65, para detectar variabilidades genéticas, por ejemplo SNP en seres humanos.

67. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 65 a 66, para detectar resistencias, tolerancias o intolerancias, o alergias a medicamentos.

68. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 65 a 66, para genotipado.

69. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 65 a 68, para detectar organismos o cepas genéticamente 5 modificados, por ejemplo organismos o cepas de bacterias o virus.

70. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 65 a 69, para diagnosticar enfermedades, por ejemplo enfermedades genéticas, enfermedades alérgicas, enfermedades autoinmunitarias o enfermedades infecciosas

71. Uso del método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 37 o el kit de reactivo de la reivindicación 38, para detectar la función y/o expresión de genes. 10

72. Uso del método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 37 o el kit de reactivo de la reivindicación 38, para la protección de marcas.

73. El uso de la reivindicación 72, para detectar información específica codificada en productos.

74. El uso del método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 37 o del kit de reactivo de la reivindicación 38, para aplicaciones nutricionales, particularmente en el área de los piensos. 15

75. El uso del método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 37 o del kit de reactivo de la reivindicación 38, para un análisis epigenético.

76. El uso de la reivindicación 75, para el análisis de un patrón de metilación de ADN.

77. Un compuesto, obtenible como el producto de reacción del método de la reivindicación 56.

78. Un producto de asociación del compuesto de la reivindicación 77 con un ácido nucleico complementario. 20