MUTEÍNA DE INTERFERÓN BETA HUMANO.

Una muteína de interferón beta humano que comprende una secuencia glicina-asparragina-isoleucinatreonina-valina en el extremo C-terminal de un polipéptido que tiene actividad de interferón beta humano y que tiene una cadena de azúcar N-unida en la posición de la secuencia glicina-asparragina-isoleucina-treoninavalina

La presente invención se refiere a una muteína de interferón beta humano. En particular, la presente invención se refiere a la muteína de interferón beta humano que tiene una o dos cadenas adicionales de azúcar comparado con el interferón beta humano natural. Antecedentes de la invención El interferón (IFN) que es un miembro de las citoquinas muestra actividad antivírica, suprime la proliferación celular y regula la respuesta inmune natural. El interferón beta (IFN-ß) es una proteína esférica que tiene 5 hélices y tiene un peso molecular de 22 kDa que se convierte en 18 kDa cuando se elimina su cadena de azúcar (Arduini et al., Protein Science 8: pp. 1867-1877,1999). El interferón beta se ha estudiado activamente por sus aplicaciones clínicas, y en particular, ha sido el centro de atención como agente para el alivio, mitigación o tratamiento de síntomas de esclerosis múltiple (Goodkin et al., Multiple sclerosis: Treatment options for patients with relapsing-remitting and secondary progressive multiple sclerosis, 1999). Además de la esclerosis múltiple, se ha descrito que el interferón beta muestra diversas actividades inmunológicas tales como actividad antivírica, inhibición del crecimiento celular o actividad anti-crecimiento, aumento de la linfotoxicidad, actividad inmunorreguladora, inducción o supresión de la proliferación de células diana, activación de macrófagos, aumento de la producción de citoquinas, aumento del efecto de células T citotóxicas, aumento de las células citolíticas naturales y, por tanto, se usa de forma eficaz para el tratamiento de cáncer, trastornos autoinmunes, infecciones víricas, enfermedades relacionadas con VIH, hepatitis C, artritis reumatoide y similares (Pilling et al., European Journal of Immunology 29: pp. 1041-1050, 1999, Young et al., Neurology 51: pp. 682-689, 1998; Cirelli et al., Major therapeutic uses of interferons. Clin Immunother 3: pp. 27-87,1995). El interferón beta humano es un tipo de glicoproteína unido a una o más cadenas de azúcar, y tal cadena de azúcar desempeña un papel importante en la actividad de la glicoproteína. Por tanto, hay un ejemplo donde la actividad de una glicoproteína aumenta cuando se introduce adicionalmente una cadena de azúcar en la misma. La publicación de PCT No. WO96/25498 y la patente de EE UU No. 5.618.698 han divulgado que las actividades de las glicoproteínas hTPO y hEPO aumentan al introducir una o más cadenas de azúcar. El documento WO 2004019856 se refiere a una isoforma de interferón alfa humano con aminoácido modificado que tiene al menos una de la secuencia Asn-X-Ser/Thr (N-X-S/T) formada en un sitio específico de modo que la glicosilación tiene lugar en este sitio y un gen que codifica la misma, un vector de expresión que comprende el gen, y un método para producir la isoforma alfa de interferón humano glicosilada mediante la transformación o transfección de una célula eucariota con el vector de expresión, cultivo de la célula transfectada o transformada y aislamiento de la isoforma alfa del interferón humano glicosilada del cultivo, la isoforma alfa de interferón humano glicosilada producida a partir del mismo y una composición farmacéutica que comprende la misma. La presente invención ha divulgado una muteína de interferón beta humano que tiene actividad o capacidad aumentada o mejorada al introducir una cadena de azúcar en el interferón beta humano natural, como un punto de vista descrito anteriormente. Según esto, en una forma de realización de la presente invención, se proporciona una muteína de interferón beta humano que tiene actividad o capacidad aumentada o mejorada al introducir una cadena de azúcar en un interferón beta humano natural. Otros objetos o formas de realización según la presente invención se proporcionan en el presente documento posteriormente. Descripción detallada de la invención En una forma de realización preferida, la presente invención se refiere a una muteína de interferón beta humano. Puesto que la muteína de interferón beta humano de la presente invención toma la forma de introducir una o dos cadenas adicionales de azúcar al interferón beta natural, muestra actividad antivírica, actividad de supresión del 2   crecimiento celular, capacidad inmunorreguladora mejoradas o aumentadas y semivida in vivo prolongada (véanse las figuras 7 a 10). Como se describe en los siguientes ejemplos, en el caso de expresar el polipéptido en el que se ha sustituido el aminoácido 27, arginina (R) en el interferón beta humano natural que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 con treonina (T) o serina (S) o se ha añadido una secuencia glicina-asparragina-isoleucina-valina (G-N-I-T-V) al extremo C-terminal del interferón beta humano natural en una célula animal, la presente invención puede preparar una muteína de interferón beta humano que tiene actividad o capacidad mejorada o aumentada comparada con el interferón beta humano natural al introducir una o dos cadenas adicionales de azúcares N-unidas en el interferón beta natural. La presente invención se proporciona basándose en estos resultados experimentales. La muteína de interferón beta humano que tiene actividad o capacidad aumentada o mejorada comparado con el interferón beta humano natural se caracteriza por la inclusión de la secuencia glicina-asparragina-isoleucina-valina (G-N-I-T-V) en el extremo C-terminal en la secuencia de aminoácidos del interferón beta humano natural o una muteína de interferón beta humano natural y que tiene una cadena de azúcar N-unida en esa posición de secuencia. El término muteína de interferón beta humano natural usado en el presente documento incluyendo las reivindicaciones significa todos los polipéptidos que tienen una parte de o la secuencia de aminoácidos completa derivada del interferón beta humano natural que mantiene la actividad de interferón beta humano. El término actividad de interferón beta humano usado en el presente documento significa una o más actividades suficientes para definir un polipéptido como interferón beta humano entre las actividades previamente conocidas que muestra el interferón beta humano. Tales actividades incluyen actividad para aliviar, mitigar o tratar esclerosis múltiple, actividad antivírica, inhibición del crecimiento celular, actividad anticrecimiento, anti-proliferación, aumento de linfotoxicidad, actividad inmunorreguladora, inducción o supresión de la proliferación de células diana, aumento de la producción de citoquinas, aumento del efecto de células T citotóxicas, aumento de células citolíticas naturales, actividad para prevenir o tratar cáncer, prevención o tratamiento de trastornos autoinmunes, prevención o tratamiento de infecciones víricas, prevención o tratamiento de enfermedades relacionadas con VIH, prevención o tratamiento de hepatitis C y prevención o tratamiento de artritis reumatoide. Además, el término polipéptido que tiene una parte de o la secuencia de aminoácidos completa derivada del interferón beta humano natural usada en el presente documento significa un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos completa del interferón beta humano natural representada por SEQ ID NO: 1 o una parte esencial de la misma, o un polipéptido sustancialmente similar a tal polipéptido. El término polipéptido que incluye una parte esencial del total de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 usada en el presente documento significa un polipéptido que muestra actividad relativamente menor que el interferón beta humano natural que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, pero contiene una parte de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 que todavía tiene la actividad de interferón beta humano. Además, el término polipéptido sustancialmente similar a la secuencia de aminoácidos completa de SEQ ID NO: 1 o una parte esencial de la misma usado en el presente documento significa un polipéptido que muestra actividad relativamente menor que el interferón beta humano natural que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, pero contiene la secuencia de aminoácidos completa de SEQ ID NO: 1 o una parte esencial de la misma que tiene uno o más aminoácidos sustituidos y que tiene aún la actividad de interferón beta humano. Por ejemplo, el polipéptido que incluye una parte esencial de la secuencia de aminoácidos completa de SEQ ID NO: 1 puede ser un polipéptido al que se ha delecionado su extremo N-terminal y/o C-terminal en el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Además, el polipéptido sustancialmente similar a la secuencia de aminoácidos completa de SEQ ID NO: 1 o una parte esencial de la misma se ejemplifica por un polipéptido que tiene uno o más aminoácidos sustituidos en donde el aminoácido sustituido es químicamente equivalente al aminoácido original antes... [Seguir leyendo]

1. Una muteína de interferón beta humano que comprende una secuencia glicina-asparragina-isoleucinatreonina-valina en el extremo C-terminal de un polipéptido que tiene actividad de interferón beta humano y que tiene una cadena de azúcar N-unida en la posición de la secuencia glicina-asparragina-isoleucina-treoninavalina. 2. La muteína de interferón beta humano de la reivindicación 1, en donde el polipéptido que tiene actividad de interferón beta humano es un interferón beta humano natural que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o una parte esencial del mismo que tiene actividad de interferón beta humano. 3. La muteína de interferón beta humano de la reivindicación 1, en donde el polipéptido que tiene actividad de interferón beta humano tiene una sustitución de la arginina que corresponde a la arginina en la posición 27 de SEQ ID NO: 1 con serina o treonina y por tanto, contiene una cadena adicional de azúcar N-unida en esa posición de secuencia. 4. La muteína de interferón beta humano de la reivindicación 1, en donde el polipéptido que tiene actividad de interferón beta humano tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 que tiene la sustitución del aminoácido 27, arginina con treonina o serina, contiene las secuencias de aminoácidos del 25 al 28 que consiste en asparragina-glicina-treonina/serina-leucina por tal sustitución, y por tanto, contiene una cadena adicional de azúcar N-unida en esa posición de la secuencia asparragina-glicina-treonina/serina-leucina. 5. Una muteína de interferón beta humano que tiene una sustitución de la arginina que corresponde a la arginina en la posición 27 de SEQ ID NO: 1 con serina o treonina de un polipéptido que tiene actividad de interferón beta humano y por tanto, contiene una cadena de azúcar N-unida en esa posición de secuencia. 6. La muteína de interferón beta humano de la reivindicación 5, en donde el polipéptido que tiene actividad de interferón beta humano es un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o una parte esencial de la misma que tiene la actividad de interferón beta humano. 7. Un polinucleótido que codifica cualquiera de las muteínas de interferón beta humano de las reivindicaciones 1 a 6. 8. El polinucleótido de la reivindicación 7, en donde la muteína de interferón beta humano es una muteína de interferón beta humano que incluye una secuencia glicina-asparragina-isoleucina-treonina-valina en el extremo C-terminal de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. 9. El polinucleótido de la reivindicación 7, en donde la muteína de interferón beta humano es una muteína de interferón beta humano que incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. 10. El polinucleótido de la reivindicación 7, en donde la muteína de interferón beta humano es una muteína de interferón beta humano que incluye una secuencia glicina-asparragina-isoleucina-treonina-valina en el extremo C-terminal de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. 11. Un vector de expresión que expresa una muteína de interferón beta humano en una célula animal que comprende cualquiera de los polinucleótidos que codifican la muteína de interferón beta humano de las reivindicaciones 7 a 10. 12. Una célula animal transfectada con el vector de expresión de la reivindicación 11. 13. Un método para preparar una muteína de interferón beta humano que comprende el paso de cultivar la célula animal de la reivindicación 12. 14. Una composición farmacéutica que comprende cualquiera de las muteínas de interferón beta humano de las reivindicaciones 1 a 6. 15. La composición farmacéutica de la reivindicación 14, que muestra un efecto farmacológico de interferón beta humano natural. 16. La composición farmacéutica de la reivindicación 14 que tiene un efecto farmacológico de interferón beta humano natural, en donde dicho efecto farmacológico es prevenir o tratar enfermedades seleccionadas del grupo que consiste en esclerosis múltiple, cáncer, trastornos autoinmunes, infecciones víricas, enfermedades relacionadas con VIH y hepatitis C. 17   18   19     21   22   23   24     26   27