MUTANTES FÚNGICOS FILAMENTOSOS CON EFICIENCIA MEJORADA DE RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA.

Método para aumentar la eficiencia de integración direccionada de un polinucleótido en un sitio predeterminado del genoma de una célula fúngica filamentosa con preferencia para NHR,

en donde dicho polinucleótido tiene una región de homología con dicho sitio predeterminado, comprendiendo dicho método proporcionar un mutante de una célula fúngica filamentosa parental, en donde la relación de NHR/HR está reducida al menos en un 50% en el mutante en comparación con dicha relación en dicho organismo parental medida en las mismas condiciones, en donde el mutante es, preferiblemente de modo inducible, deficiente en al menos un componente implicado en NHR, y/o tiene una cantidad reducida de al menos uno de dichos al menos un componente, en donde dicho componente se selecciona del grupo constituido por homólogos fúngicos filamentosos de levadura KU80, KU70, RAD50, MRE11, XRS2, LIG4, SIR4, LIFL y NEIL

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2005/051464.

Solicitante: DSM IP ASSETS B.V..

Nacionalidad solicitante: Países Bajos.

Dirección: HET OVERLOON 1 6411 TE HEERLEN PAISES BAJOS.

Inventor/es: BERG,VAN DEN,MARCO,ALEXANDER, DEKKER,PETRUS,JACOBUS,THEODORUS.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 31 de Marzo de 2005.

Fecha Concesión Europea: 8 de Septiembre de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07K14/37 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02;   proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de hongos.
  • C12N15/80 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › para hongos.
  • C12N15/90B
  • C12P21/02 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.C12P 21/00 Preparación de péptidos o de proteínas (proteína monocelular C12N 1/00). › que tienen una secuencia conocida de varios aminoácidos, p. ej. glutation.
  • C12P23/00 C12P […] › Preparación de compuestos que contienen un ciclo ciclohexeno con una cadena lateral insaturada de al menos diez átomos de carbono unidos por enlaces dobles conjugados, p. ej. carotenos (que contienen heterociclos C12P 17/00).
  • C12P37/00 C12P […] › Preparación de compuestos que contienen un sistema cíclico 4-tia 1-aza biciclo [3.2.0] heptano, p. ej. penicilina.

Clasificación PCT:

  • C12N15/90 C12N 15/00 […] › Introducción estable de ADN extraño en el cromosoma.
  • C12N5/00 C12N […] › Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00).

Clasificación antigua:

  • C12N15/90 C12N 15/00 […] › Introducción estable de ADN extraño en el cromosoma.
  • C12N5/00 C12N […] › Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00).

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania.


Fragmento de la descripción:

Mutantes fúngicos filamentosos con eficiencia mejorada de recombinación homóloga.

Campo de la invención

La invención se refiere al campo de la biología molecular. La misma se refiere particularmente a métodos para mejorar la eficiencia de la integración directa de ácidos nucleicos en el genoma de un hongo filamentoso, y usos de los mismos.

Antecedentes de la invención

Las células eucariotas son organismos preferidos para la producción (recombinante) de polipéptidos y metabolitos secundarios. Cuando se construye, por ejemplo, una cepa de producción de proteínas, el sitio de integración del gen de interés que codifica la proteína a producir es crucial para la regulación de la transcripción y/o expresión del gen integrado de interés. Dado que en la mayoría de los organismos eucariotas la integración del DNA en el genoma ocurre con alta frecuencia de modo aleatorio, la construcción de una cepa de producción de proteínas por tecnología de DNA recombinante conduce a menudo a la integración aleatoria indeseable de la casete de expresión que comprende el gen que codifica la proteína a producir. Esta "integración múltiple aleatoria" descontrolada de una casete de expresión es un proceso potencialmente peligroso, que puede conducir a una modificación indeseable del genoma del hospedador. Por consiguiente, es sumamente deseable poder construir una cepa de producción de proteínas asegurando el direccionamiento correcto de la casete de expresión con eficiencia alta.

Adicionalmente, ahora que está haciéndose disponible la secuencia de genomas completos de una cantidad creciente de organismos, ello abre la oportunidad de construir bibliotecas genómicas que abarcan sobreexpresión y deleción. Un requisito importante para la construcción eficiente de tales bibliotecas es que el organismo en cuestión pueda transformarse eficientemente y que la homología requerida necesaria para dirigir la integración direccionada de un ácido nucleico en el genoma sea relativamente corta.

Las células eucariotas tienen al menos dos caminos separados (uno por recombinación homóloga y otro por recombinación no homóloga) a través de los cuales los ácidos nucleicos (en particular, por supuesto, DNA) pueden integrarse en el genoma hospedador. La levadura Saccharomyces cerevisiae es un organismo con preferencia para recombinación homóloga (HR). La relación de recombinación no homóloga a homóloga (NHR/HR) de este organismo puede variar desde aproximadamente 0,07 a 0,007.

WO 02/052026 describe mutantes de Saccharomyces cerevisiae que tienen una eficiencia de direccionamiento mejorada de secuencias de DNA a su genoma. Tales cepas mutantes son deficientes en un gen implicado en NHR (KU70).

Contrariamente a Saccharomyces cerevisiae, la mayoría de los eucariotas superiores tales como células de hongos filamentosos hasta células de mamífero, tienen preferencia para NHR. Entre los hongos filamentosos, la relación NHR/HR está comprendida entre 1 y más de 100. En tales organismos, la frecuencia de integración direccionada es bastante baja. Para mejorar esta frecuencia, la longitud de las regiones homólogas que flanquean una secuencia de polinucleótidos a integrar en el genoma de tales organismos tiene que ser relativamente larga, por ejemplo de al menos 2000 pb para romper un solo gen y al menos 500 pb para cribado de transformantes supuestos. La necesidad de tales regiones flanqueantes representa una carga pesada cuando se somete a clonación el constructo de DNA que comprende dicho polinucleótido y cuando se transforma con él el organismo. Además, los genes vecinos que caen dentro de dichas regiones flanqueantes pueden verse alterados fácilmente durante los procesos de recombinación que siguen a la transformación, causando con ello efectos secundarios indeseables e inesperados.

Células de mamífero deficientes de KU70 han sido ya aisladas (Pierce et al, Genes and Development, (2001), 15:3237-3242). Estos mutantes tienen una frecuencia de reparación dirigida por homología 6 veces mayor, pero no presentan aumento alguno en la eficiencia de la integración direccionada dirigida por homología. Esto sugiere que los resultados obtenidos en organismos que tienen preferencia para HR (Saccharomyces cerevisiae) no pueden extrapolarse a organismos con preferencia para NHR.

Ninomiya et al, Genes Genet. Syst. (2003) 78: 463, resumen 1D-10, describe el análisis de genes de recombinación no homóloga, ncku70 y ncku80, en Neurospora crassa. La frecuencia de integración homóloga de DNA ectópico en el mutante ncku era mayor que la del tipo salvaje.

Sorprendentemente, se ha encontrado que la conducción de los caminos de integración de los ácidos nucleicos hacia HR en los hongos filamentosos daba como resultado una eficiencia mejorada para la integración direccionada de ácidos nucleicos en el genoma de los hongos filamentosos.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 representa el vector de reemplazamiento pDEL-HDFA utilizado para desactivar el gen hdfA en Aspergillus niger (A. niger). El vector de reemplazamiento comprende las regiones flanqueantes de hdfA, el marcador amdS y DNA de E. coli. El DNA de E. coli se separó por digestión con las enzimas de restricción AscI y NotI, antes de transformación de las cepas de A. niger.

La Figura 2 representa el vector de reemplazamiento pDEL-HDFB utilizado para desactivar el gen hdfB en A. niger. El vector de reemplazamiento comprende las regiones flanqueantes de hdfB, el marcador amdS y DNA de E. coli. El DNA de E. coli se separó por digestión con las enzimas de restricción AscI y NotI, antes de transformación de las cepas de A. niger.

La Figura 3 representa la estrategia utilizada para seleccionar el gen hdfA de A. niger. El constructo de DNA utilizado comprende el marcador de selección amdS flanqueado por las regiones homólogas (5' y 3') del gen hdfA (1). Este constructo se integra por doble recombinación homóloga (X) en el locus genómico de hdfA (2) y reemplaza la copia del gen genómico hdfA (3). Subsiguientemente, la recombinación en las repeticiones directas (U) elimina el marcador amdS, dando como resultado la escisión precisa del gen hdfA (4).

La Figura 4 representa la estrategia utilizada para seleccionar el gen hdfB de A. niger. El constructo de DNA comprende el marcador de selección amdS flanqueado por las regiones homólogas (5' y 3') del gen hdfB (1). Este constructo se integra por recombinación doble homóloga (X) en el locus genómico hdfB (2) y reemplaza la copia del gen genómico hdfB (3). Subsiguientemente, la recombinación en las repeticiones directas (U) elimina el marcador amdS, dando como resultado una escisión precisa del gen hdfB (4).

La Figura 5 representa la estrategia esquemática utilizada para integrar un constructo de DNA en el genoma de A. niger por recombinación homóloga simple. El vector de expresión comprende el marcador seleccionable amdS y un gen de interés flanqueado por las regiones homólogas del locus glaA (3' glaA y 3'' glaA, respectivamente) para dirigir la integración en el locus genómico glaA.

Descripción de la invención

Método para aumentar la eficiencia de la integración direccionada de un polinucleótido en el genoma de una célula de hongo filamentoso

La presente invención proporciona un método de acuerdo con la reivindicación 1.

En el contexto de la invención, el camino HR se define como todos los genes y elementos que están implicados en el control de la integración direccionada de polinucleótidos en el genoma de un hospedador, teniendo dichos polinucleótidos una cierta homología con un cierto sitio predeterminado del genoma de un hospedador en el que se direcciona la integración. El camino NHR se define como todos los genes y elementos que están implicados en el control de la integración del polinucleótido en el genoma de un hospedador, con indiferencia del grado de homología de dichos polinucleótidos con la secuencia genómica del hospedador.

La conducción comprende proporcionar un mutante de una célula parental de hongo filamentoso, en donde la relación NHR/HR se ha reducido en el mutante al menos un 50%, y muy preferiblemente...

 


Reivindicaciones:

1. Método para aumentar la eficiencia de integración direccionada de un polinucleótido en un sitio predeterminado del genoma de una célula fúngica filamentosa con preferencia para NHR, en donde dicho polinucleótido tiene una región de homología con dicho sitio predeterminado, comprendiendo dicho método proporcionar un mutante de una célula fúngica filamentosa parental, en donde la relación de NHR/HR está reducida al menos en un 50% en el mutante en comparación con dicha relación en dicho organismo parental medida en las mismas condiciones, en donde el mutante es, preferiblemente de modo inducible, deficiente en al menos un componente implicado en NHR, y/o tiene una cantidad reducida de al menos uno de dichos al menos un componente, en donde dicho componente se selecciona del grupo constituido por homólogos fúngicos filamentosos de levadura KU80, KU70, RAD50, MRE11, XRS2, LIG4, SIR4, LIFL y NEIL.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde un gen implicado en NHR ha sido reemplazado por una variante no funcional.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde el mutante tiene un nivel incrementado de un componente implicado en HR.

4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde se utiliza una célula fúngica filamentosa que tiene una relación NHR/HR menor que 50, preferiblemente menor que 10, aún más preferiblemente menor que 1, y muy preferiblemente menor que 0,001.

5. Un mutante de una célula fúngica filamentosa parental, teniendo el organismo parental una preferencia para NHR, en donde la relación de NHR/HR está reducida al menos en un 50% en el mutante en comparación con dicha relación en dicho organismo parental medida en las mismas condiciones, en donde el mutante es, preferiblemente de modo inducible, deficiente en al menos un componente implicado en NHR, y/o tiene una cantidad reducida de al menos uno de dichos al menos un componente, en donde dicho componente se selecciona del grupo constituido por homólogos fúngicos filamentosos de levadura KU80, KU70, RAD50, MRE11, XRS2, LIG4, SIR4, LIFL y NEIL.

6. La célula fúngica filamentosa mutante de acuerdo con la reivindicación 5, en donde en el genoma del organismo un gen implicado en NHR ha sido reemplazado por una variante no funcional.

7. La célula fúngica filamentosa mutante de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6, en donde el mutante tiene un nivel incrementado de un componente implicado en HR.

8. La célula fúngica filamentosa mutante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en donde el mutante es un mutante recombinante.

9. El mutante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8 que tiene una relación NHR/HR menor que 50, preferiblemente menor que 10, aún más preferiblemente menor que 1, y muy preferiblemente menor que 0,001.

10. El mutante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8 en donde un camino no deseado se ha modificado, preferiblemente por desactivación de genes.

11. La célula fúngica filamentosa mutante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10 transformada con un constructo de DNA que comprende una secuencia de DNA que comprende un gen de interés que codifica un polipéptido de interés.

12. La célula fúngica filamentosa mutante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11, en donde la célula fúngica filamentosa es una especie de Aspergillus, Penicillium o Trichoderma.

13. La célula fúngica filamentosa mutante de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el Aspergillus es una especie de Aspergillus niger o una especie de Aspergillus oryzae.

14. La célula fúngica filamentosa mutante de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el Penicillium es una especie de Penicillium chrysogenum o Penicillium citrinum.

15. Uso de la célula fúngica filamentosa de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 14, para producir un polipéptido de interés.

16. Uso de la célula fúngica filamentosa mutante de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 14, para producción de un metabolito.

17. Uso de acuerdo con la reivindicación 16, en donde el metabolito es un compuesto carotenoide o un compuesto de beta-lactama.

18. Método para producción de un polipéptido de interés, que comprende:

a) proporcionar un mutante de una célula fúngica filamentosa parental, en donde la relación de NHR/HR está reducida al menos en un 50 en el mutante en comparación con dicha relación en dicho organismo parental medida en las mismas condiciones, en donde el mutante es, preferiblemente de modo inducible, deficiente en al menos un componente implicado en NHR, y/o tiene una cantidad reducida de al menos uno de dichos al menos un componente, en donde dicho componente se selecciona del grupo constituido por homólogos fúngicos filamentosos de levadura KU80, KU70, RAD50, MRE11, XRS2, LIG4, SIR4, LIFL y NEIL,

b) transformar el mutante obtenido en (a) con un constructo de DNA que comprende una secuencia de DNA que comprende un gen de interés que codifica un polipéptido de interés,

c) cultivar la célula obtenida en (b) en condiciones que conducen a la producción del polipéptido de interés, y

d) recuperar el polipéptido de interés.

19. Un método para producir un metabolito en donde se utiliza el hongo filamentoso de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 14.

20. El método de acuerdo con la reivindicación 18 ó 19, en donde un gen implicado en NHR ha sido reemplazado por una variante no funcional.

21. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, en donde el mutante tiene un nivel incrementado de un componente implicado en HR.

22. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, en donde la célula fúngica filamentosa mutante es una especie de Aspergillus, Penicillium o Trichoderma.


 

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