MUTANTE DEL GEN PROB DE LAS BACTERIAS CORINEFORMES.

Polinucleótidos que codifican polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos que son al menos 90% idénticas a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO:

2, con lo que en las secuencias de aminoácidos la glicina en la posición 149 se sustituye por un aminoácido proteinogénico, con lo que el polipéptido tiene actividad de γ-glutamil cinasa

La presente invención se refiere a una enzima que tiene actividad de -glutamil cinasa. Más particularmente, la presente invención caracteriza a aquellas enzimas que tienen un aminoácido proteinogénico distinto de glicina en la posición 149 de la secuencia de aminoácidos.

Las enzimas que tienen actividad de -glutamil cinasa se emplean preferiblemente en la producción por fermentación de L-prolina. En el esquema 1 se representa la ruta biosintética de la L-prolina, partiendo de glutamato.

**(Ver fórmula)**

Es sabido que los aminoácidos se pueden producir fermentando cepas de, por ejemplo, bacterias corineformes, en particular Corynebacterium glutamicum. Debido a la gran importancia, se están realizando constantemente esfuerzos para mejorar los procesos de producción. Las mejoras en el procedimiento pueden implicar medidas de relacionadas con la tecnología de la fermentación, tales como, por ejemplo, la agitación y el suministro de oxígeno, o la composición de los medios nutrientes, tal como, por ejemplo, la concentración de azúcar durante la fermentación,

o el tratamiento hasta obtener la forma del producto, por ejemplo por medio de cromatografía de intercambio iónico,

o las propiedades intrínsecas de comportamiento del microorganismo propiamente dicho.

Las propiedades de comportamiento de estos microorganismos se mejoran aplicando métodos de mutagénesis, selección y elección de mutantes. Esto da como resultado cepas que son resistentes a antimetabolitos o son auxótrofas para metabolitos importantes para la regulación y que producen aminoácidos. Un antimetabolito conocido es el análogo de prolina 3,4-deshidro-DL-prolina (DHP).

Desde hace varios años se han empleado igualmente métodos de ADN recombinante para mejorar las cepas de Corynebacterium que producen L-aminoácidos, amplificando genes de la biosíntesis de aminoácidos individuales e investigando el efecto sobre la producción de aminoácidos.

La secuencia nucleotídica del genoma de Corynebacterium glutamicum se describe, entre otros, en el documento EP-A-1108790, y también se ha depositado en la base de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI) de la National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA) con los números de acceso NC_003450.2 y BX927148.1 a BX927157.1.

Sleator et al. dan a conocer la posibilidad de provocar sobreproducción en la biosíntesis de prolina mutando el gen proB de Listeria monocytogenes (Appl. Environ. Microbiol. 2001, 67, 4560-5). Las mutaciones especificadas allí y declaradas como exitosas implican genes de proB que codifican -glutamil cinasas que tienen las siguientes mutaciones: V121I, A144V y E146K. Además, se hace mención al hecho de que las regiones en las que se producen estas mutaciones corresponden muy bien a la región también identificada en otros organismos como una región diana para mutaciones ventajosas.

Por lo tanto, fue el objeto de la presente invención hacer que estén disponibles otras variantes proteicas mutadas y, cuando sea apropiado, mejoradas de una -glutamil cinasa, que se pueden emplear ventajosamente en un proceso técnico para la producción de L-prolina por fermentación.

Este objeto y otros objetos que no se especifican con detalle pero que surgen de manera obvia a partir de la técnica anterior se logran partiendo de las -glutamil cinasas de la reivindicación 1. La reivindicación 2 se centra en enzimas preferidas de este tipo. La reivindicación 3 y 4 se refiere a las secuencias nucleotídicas que codifican estas enzimas, respectivamente, mientras que la reivindicación 5 se centra en vehículos producidos de forma recombinante que tienen las secuencias nucleotídicas recién mencionadas. Finalmente, la reivindicación 5 se refiere a un proceso de producción según la invención para la L-prolina con la ayuda de las enzimas mencionadas.

Proporcionando una -glutamil cinasa (producto del gen proB) que tiene un aminoácido proteinogénico distinto de glicina en la posición 149 de los aminoácidos, sorprendentemente, aunque no menos ventajosamente, se logra de forma particular el objeto expuesto. En comparación con las enzimas de tipo salvaje, las -glutamil cinasas que tienen una mutación apropiada ayudan a producir L-prolina de manera mejorada en un proceso de producción por fermentación. Usando los métodos según la invención, es posible mejorar el comportamiento de los organismos hospedantes o del proceso de fermentación con respecto a uno o más de los parámetros seleccionados del grupo de concentración de producto (producto por volumen), rendimiento de producto (producto formado por fuente de carbono consumida) y formación de producto (producto formado por volumen y tiempo), o cualesquiera otros parámetros del proceso y sus combinaciones en al menos 0,5%, al menos 1%, al menos 1,5% o al menos 2%, basándose en la cepa de partida o cepa progenitora o el proceso de fermentación con el uso de dichas enzimas.

Se da preferencia a proporcionar -glutamil cinasas en las que un aminoácido, preferiblemente el L-aminoácido, seleccionado del grupo que consiste en Lys, Asn, Arg, Ser, Thr, Ile, Met, Glu, Asp, Ala, Val, Gln, His, Pro, Leu, Tyr, Trp, Cys o Phe está presente en la posición del aminoácido como se define según la invención. (Los aminoácidos mencionados, incluyendo glicina, también se denominan en la técnica como aminoácidos proteinogénicos). Se da una preferencia muy particular a la sustitución de glicina con ácido L-aspártico en la posición 149 (G149D) en la mencionada enzima. Se da la máxima preferencia a una -glutamil cinasa según la invención, como se especifica anteriormente, que tiene una longitud de 369 ± 40, preferiblemente ± 20, más preferiblemente ± 10 y preferiblemente de forma muy particular ± 5 aminoácido o ± 3 aminoácidos. Se sabe que las enzimas intrínsecas al hospedante, denominadas aminopeptidasas, son capaces de escindir el aminoácido N-terminal metionina, separándolo de la proteína formada. Además, se sabe que la escisión de uno (1) o dos (2) y de no más de tres (3) aminoácidos del término C de la proteína altera la actividad enzimática sólo de forma insignificante como mucho, si es que lo hace. Sin embargo, la enzima puede aumentar en longitud debido a la anexión de ciertas proteínas de fusión (véase más abajo).

La presente invención también engloba la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2, preferiblemente 4, o una secuencia que es al menos 90% idéntica a ella, comprendiendo las secuencias la sustitución de aminoácidos de glicina por otro aminoácido, en particular cualquiera de los aminoácidos preferidos mencionados, en la posición 149. De este modo, la invención también engloba aquellas enzimas que tienen los grados mencionados anteriormente de identidad a nivel de aminoácidos en comparación con SEC ID NO: 2, preferiblemente 4. Igualmente, estas enzimas se pueden originar a partir de fuentes naturales. Como alternativa, se pueden haber modificado mediante tecnología de ADN recombinante, de tal manera que el experto puede predecir la actividad enzimática a retener o esencialmente retenida (véase, por ejemplo, Sambrook et al, “Molecular Cloning, A Laboratory Handbook”, 2ª edición 1989, CSH Press, Cold Spring Harbor, Ausubel et al. “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons, NY 2001). De este modo, los aminoácidos que no están presentes en el sitio activo y cuya sustitución por un aminoácido “del mismo tipo” no se espera que dé como resultado, a primera vista, una estructura tridimensional sustancialmente alterada se pueden sustituir por un aminoácido “del mismo tipo”. Por ejemplo, se puede esperar que ciertos aminoácidos con cadenas laterales no polares (aminoácidos del mismo tipo) se puedan sustituir, por ejemplo isoleucina por valina, sin que esto tenga una influencia (sustancial) sobre la función biológica o enzimática de la enzima según la invención, o sobre la actividad enzimática. El experto puede alcanzar, basándose en su conocimiento, conclusiones correspondientes también para la sustitución de otros tipos de aminoácidos (por ejemplo la sustitución de aminoácidos básicos por otros aminoácidos básicos, o de aminoácidos con cadenas laterales polares no cargadas por otros aminoácidos de este grupo).

Igualmente se da preferencia a una -glutamil cinasa que tiene al menos la secuencia de aminoácidos correspondiente a las posiciones 145 a 154, más preferiblemente 130 a 169, y preferiblemente de forma muy particular... [Seguir leyendo]

1. Polinucleótidos que codifican polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos que son al menos 90% idénticas a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID NO: 2, con lo que en las secuencias de aminoácidos la glicina en la posición 149 se sustituye por un aminoácido proteinogénico, con lo que el polipéptido tiene actividad de glutamil cinasa.

2. Los polinucleótidos según la reivindicación 1, en los que el intercambio de aminoácidos se selecciona de SEC ID NO: 2, en los que la glicina en la posición 149 se sustituye por un aminoácido proteinogénico.

3. Los polinucleótidos según las reivindicaciones 1 ó 2, en los que la glicina en la posición 149 de SEC ID NO: 2 se sustituye por ácido L-aspártico.

4. Los polinucleótidos de la reivindicación 3, en los que dichos polinucleótidos comprenden la secuencia nucleotídica de SEC ID NO: 3.

5. Polinucleótidos que codifican polipéptidos que tienen desde las posiciones 145 a 154 la secuencia de aminoácidos de las posiciones 145 a 154 de SEC ID NO: 2, en los que dicho polinucleótido se hibrida en condiciones restrictivas que comprenden una etapa de lavado a 0,5 SSC a 52-68ºC al complemento de SEC ID NO: 3, en los que el polipéptido tiene actividad de -glutamil cinasa.

6. Los polinucleótidos de la reivindicación 5, en los que dichos polipéptidos codificados tienen desde las posiciones 145 a 154 la secuencia de aminoácidos de las posiciones 145 a 154 de SEC ID NO: 4.

7. Los polinucleótidos de la reivindicación 5, en los que dichos polipéptidos codificados tienen desde las posiciones 110 a 189 la secuencia de aminoácidos de las posiciones 110 a 189 de SEC ID NO: 2.

8. Los polinucleótidos de la reivindicación 6, en los que dichos polipéptidos codificados tienen desde las posiciones 110 a 189 la secuencia de aminoácidos de las posiciones 110 a 189 de SEC ID NO: 4.

9. Un vector que comprende un polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

10. Polipéptidos que tienen las secuencias de aminoácidos que son al menos 90% idénticas a la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 2, con lo que el polipéptido tiene actividad de -glutamil cinasa, y en la posición 149 de la secuencia de aminoácidos la glicina se sustituye por un aminoácido proteinogénico.

11. Los polipéptidos según la reivindicación 10, que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 2 ó

4.

12. Un hospedante transformado con el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o el vector de la reivindicación 9.

13. El hospedante según la reivindicación 12, en el que dicho polinucleótido está contenido en el cromosoma.

14. El hospedante según la reivindicación 12, en el que los polinucleótidos según las reivindicaciones 1 a 8 están sobreexpresados.

15. El hospedante según la reivindicación 14, en el que la sobreexpresión se logra incrementando el número de copias de dichos polinucleótidos.

16. El hospedante según las reivindicaciones 12 a 15, con lo que el hospedante se escoge del grupo que comprende levaduras, E. coli, B. subtilis, bacterias corineformes.

17. El hospedante según la reivindicación 16, en el que dicho hospedante es una bacteria corineforme.

18. El hospedante según la reivindicación 14, en el que dicho hospedante es Corynebacterium glutamicum.

19. Un procedimiento para la preparación de L-prolina, que comprende a) fermentar el procariota/hospedante según una o más de las reivindicaciones 12 a 18 b) enriquecer dicho L-aminoácido en el medio o en las células de las bacterias, y c) aislar o recoger dicho aminoácido, opcionalmente con componentes procedentes de la fermentación y/o

biomasa.

20. El procedimiento según la reivindicación 19, en el que se fermentan los hospedantes que comprenden uno o más genes sobreexpresados escogidos del grupo que comprende:

a) el gen gdh que codifica glutamato deshidrogenasa

b) el gen proA que codifica -glutamil-fosfato reductasa c) el gen proC que codifica la pirrolin-5-carboxilato reductasa y d) el gen ocd que codifica ornitina ciclodesaminasa.

21. El procedimiento según la reivindicación 19, en el que se fermenta el procariota/hospedante que comprende uno 5 o más genes atenuados escogidos del grupo que comprende: a) el gen ilvA que codifica treonina desaminasa b) el gen putA que codifica prolina deshidrogenasa/pirrolin-5-carboxilato deshidrogenasa c) el gen sucA que codifica 2-cetoglutarato deshidrogenasa

d) el gen sucB que codifica dihidrolipoamida succiniltransferasa, y 10 e) el gen argD que codifica acetilornitina aminotransferasa.

22. El procedimiento según las reivindicaciones 19 a 21, en el que se fermentan las bacterias corineformes.

23. El procedimiento según las reivindicaciones 19 a 21, en el que se fermenta E. coli.