El uso de una cantidad efectiva de por lo menos un anticuerpo o una de sus porciones que se une a antígeno,

en el que el anticuerpo o su porción que se une a antígeno se une a un epítopo de proteína EphB4 localizado dentro de los residuos 220 a 230 de EphB4 que consiste en una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:1, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención del cáncer en un sujeto, en el que el cáncer comprende una o más células que expresan EphB4

Campo de la Invención

La presente invención se refiere a métodos para regular el cáncer. En particular, la invención se refiere a métodos para inhibir el crecimiento canceroso de una célula. La invención proporciona también métodos para prevenir o tratar el cáncer. La invención se refiere también a métodos para identificar 5 agentes que pueden inhibir el crecimiento canceroso de una célula.

**(Ver fórmula)**

**(Ver fórmula)**

**(Ver fórmula)**

**(Ver fórmula)**

**(Ver fórmula)**

**(Ver fórmula)**

**(Ver fórmula)**

**(Ver fórmula)**

**(Ver fórmula)**

**(Ver fórmula)**

**(Ver fórmula)**

**(Ver fórmula)**

**(Ver fórmula)**

**(Ver fórmula)**

**(Ver fórmula)**

**(Ver fórmula)**

**(Ver fórmula)**

**(Ver fórmula)**

**(Ver fórmula)**

**(Ver fórmula)**

**(Ver fórmula)**

**(Ver fórmula)**

**(Ver fórmula)**

Antecedentes de la invención

El cáncer describe varias enfermedades, que son el resultado del crecimiento desregulado de células del cuerpo. Se pueden desarrollar cánceres malignos a partir de este crecimiento desregulado y subsecuentemente extenderse por el cuerpo vía el torrente sanguíneo o el sistema linfático, un 10 procedimiento conocido como metástasis. Los tumores malignos de los tejidos epiteliales son la forma más común de cáncer y son responsables de la mayoría de las muertes relacionadas con el cáncer en los países occidentales industrializados. Según el Australian Institute of Health and Welfare (AIHW), en promedio uno de cada tres hombres y una de cada cuatro mujeres desarrollarán cáncer antes de la edad de 75 años (1). En los hombres los cánceres más comunes son de próstata, intestino y pulmón y en las 15 mujeres, pecho, intestino y melanoma. La identificación de los genes expresados específicamente en los tejidos tumorales y no en los tejidos normales, y el análisis de sus funciones son útiles para identificar nuevas dianas para la terapia del cáncer.

Varios genes han sido implicados en varios cánceres. Por ejemplo, se conocen oncogenes que codifican receptores del factor de crecimiento celular tal como el factor de crecimiento epidérmico. El gen 20 ras es un oncogén que se cree que es responsable de hasta el 90% de todos los cánceres pancreáticos humanos, 50% de los cánceres de colon humano, 40% de los cánceres de pulmón, y 30% de las leucemias. Los oncogenes mutados se pueden convertir en genes que provocan cáncer. Tales oncogenes mutados codifican proteínas tales como proteína quinasas y enzimas que fosforilan proteínas que desencadenan el crecimiento celular incontrolado. La EphB4 es un miembro recientemente identificado de 25 la mayor familia conocida de proteínas tirosina quinasas receptoras. Se ha identificado que los miembros de la familia de receptores Eph están implicados en muchos procesos celulares que incluyen el desarrollo neuronal, angiogénesis y desarrollo de la red vascular (2-5). Como resultado de interacciones con sus ligandos, las efrinas, median en las interacciones celulares dependientes del contacto, que regulan funciones celulares como la inhibición de contacto, la organización citoesquelética y la migración celular 30 (6,7)

Aunque se han desarrollado varios agentes anticáncer que incluyen moléculas inhibidoras del crecimiento tales como compuestos citotóxicos en un intento de tratar el cáncer, aún hay una necesidad de proporcionar métodos efectivos para regular el cáncer.

Sumario de la invención 35

La presente invención está basada en el sorprendente hallazgo de que un anticuerpo que puede unirse a una región particular de la proteína EphB4 puede inhibir ventajosamente el crecimiento canceroso en una célula cancerosa provocando la muerte celular de la célula cancerosa.

Por lo tanto, en un primer aspecto de la invención, proporciona como método in vitro para inhibir el crecimiento canceroso de una célula que expresa EphB4, comprendiendo el método poner en contacto 40 la célula con por lo menos un anticuerpo o una de sus porciones que se une a antígeno, en el que el anticuerpo o su porción que se une a antígeno se une a un epítopo de proteína EphB4 localizado dentro de los residuos 220 a 230 de EphB4 (SEQ ID NO: 1), o una secuencia por lo menos 85%, preferentemente por lo menos 90% idéntica a ella. Preferentemente, la secuencia tiene una substitución del aminoácido Asp (D) por Asn (N) en el residuo 226 de EphB4 (SEQ ID. NO:1). 45

Según un aspecto de la invención, se proporciona el uso según la reivindicación 1.

Según otro aspecto de la invención, se proporciona el uso según la reivindicación 2.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra la localización inmunohistoquímica de la expresión de EphB4 en tres cánceres de colon diferentes y mucosa normal comparada usando el anticuerpo policlonal EphB4 (H-200 50 Santa Cruz Biotechnology) específicamente dirigido a los residuos amino del dominio extracelular 201 a 400 de EphB4 (SEQ ID NO: 1). La mancha oscura del anticuerpo secundario biotinilado indica la proteína EphB4. Los núcleos se tiñen con hematoxilina Harris. Se muestran imágenes de gran aumento (x100) de tres adenocarcinomas diferentes (bien diferenciado, moderadamente bien diferenciado y poco diferenciado) y sus mucosas normales comparables. La fuerte tinción de tejido tumoral y la tinción muy 55

débil, difusa del tejido normal era evidente en cada conjunto de muestras. No había reactividad cruzada con el anticuerpo secundario solo (no se muestra el resultado).

La Figura 2 muestra la RT-PCR relativa que compara la expresión de EphB4 (1187 bp) y ARNr 18S interno (489 bp) en cinco pares tumor (T)/normal (N). LM - metástasis de hígado y NL - hígado normal de pacientes 5, CL - línea celular de cáncer de colon LIM2405, C2 - línea celular de cáncer de colon 5 SW480, RT - control negativo de RT, P - control negativo de PCR, M - marcador pUC19/HpaII.

La Figura 3 muestra una monocapa confluente de células en 2 ml de DMEM tratada con un dilución 1/500 del anticuerpo policlonal EphB4 (H-200 Santa Cruz Biotechnology) específicamente dirigido a los residuos amino del dominio extracelular 201 a 400 de EphB4 (SEQ ID NO:1) (concentración final 0,4 ng/µl). La incubación de células con el anticuerpo provoca una respuesta visual entre 24 y 48 h. Las 10 células se despegan del fondo del recipiente de cultivo en forma de lámina frágil que se rompe fácilmente con agitación suave. El cambio de color del medio es debido a un cambio de 0,5 unidades de pH atribuido a la fuga de contenidos celulares de las células muertas.

La Figura 4 muestra un gráfico que muestra el efecto de las dosis incrementadas de un anticuerpo policlonal EphB4 (H-200 Santa Cruz Biotechnology) específicamente dirigido a los residuos 15 amino del dominio extracelular 201 a 400 de EphB4 (SEQ ID NO:1) sobre el crecimiento de células MCF-7 in vitro después de 48 horas.

La Figura 5 muestra un ensayo de exclusión de azul de tripano para determinar la dependencia de la dosis de un anticuerpo policlonal EphB4 (H-200 Santa Cruz Biotechnology) específicamente dirigido a los residuos amino del dominio extracelular 201 a 400 de EphB4 (SEQ ID NO:1). El número de células 20 viables (x100000) (eje Y) disminuye después de una exposición de 48 h a tres diluciones diferentes del anticuerpo EphB4 (eje X). No quedaban células viables después de 72 h con la adición de 1 µg/ml y después de 48 h con la adición de 2 µg/ml.

La Figura 6 muestra un ensayo de Caspasa-3. La cantidad relativa de actividad de caspasa-3 por 100.000 células (eje Y) se incrementa con el tiempo para todas las diluciones de un anticuerpo policlonal 25 EphB4 (H-200 Santa Cruz Biotechnology) específicamente dirigido a los residuos amino de dominio extracelular 201 a 400 de EphB4 (SEQ ID NO:1) (eje X). Debido a que no había células viables contadas para la dilución 1/200 (1µg/ml) después de 72 horas y para la dilución 1/100 (2 µg/ml) después de...

1. El uso de una cantidad efectiva de por lo menos un anticuerpo o una de sus porciones que se une a antígeno, en el que el anticuerpo o su porción que se une a antígeno se une a un epítopo de proteína EphB4 localizado dentro de los residuos 220 a 230 de EphB4 que consiste en una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:1, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o 5 prevención del cáncer en un sujeto, en el que el cáncer comprende una o más células que expresan EphB4.

2. El uso de una cantidad efectiva de por lo menos un anticuerpo o una de sus porciones que se une a antígeno, en el que el anticuerpo o porción que se une a antígeno se une a un epítopo de proteína EphB4 localizado en una secuencia idéntica por lo menos en el 85% a los residuos 220 a 230 de EphB4 10 que consiste en una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:1, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención del cáncer en un sujeto, en el que el cáncer comprende una o más células que expresan EphB4.

3. Un uso según la reivindicación 2, en el que el anticuerpo o una de sus porciones que se une a antígeno se une a un epítopo localizado en una secuencia idéntica por lo menos en el 90% a los residuos 15 220 a 230 de EphB4 que consiste en una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:1.

4. Un uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de pecho, cáncer de próstata, cáncer de intestino, cáncer de vejiga, cáncer de colon, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, melanoma, linfoma y leucemia.

5. Un uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el cáncer es cáncer de 20 pecho o cáncer de colon.

6. Un método in vitro para inhibir el crecimiento canceroso de una célula que expresa EphB4, comprendiendo el método poner en contacto la célula por lo menos con un anticuerpo o una de sus porciones que se une a antígeno, en el que el anticuerpo o una de sus porciones que se une a antígeno se une a un epítopo de proteína EphB4 localizado dentro de los residuos 220 a 230 de EphB4 que 25 consiste en una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:1.

7. Un método in vitro para inhibir el crecimiento canceroso de una célula que expresa EphB4, comprendiendo el método poner en contacto la célula por lo menos con un anticuerpo o una de sus porciones que se une a antígeno, en el que el anticuerpo o una de sus porciones que se une a antígeno se une a un epítopo de proteína EphB4 localizado en una secuencia idéntica por lo menos en el 85% a los 30 residuos 220 a 230 de EphB4 que consiste en una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:1.

8. Un método según la reivindicación 7, en el que el anticuerpo o una de sus porciones que se une a antígeno se une a un epítopo localizado en una secuencia idéntica por lo menos en el 90% a los residuos 220 a 230 de EphB4 que consiste en una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID 35 NO:1

9. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que la célula es una célula de un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de pecho, cáncer de próstata, cáncer de intestino, cáncer de vejiga, cáncer de colon, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, melanoma, linfoma y leucemia. 40

10. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en el que la célula es una célula de un cáncer de pecho o cáncer de colon.