MÉTODOS DE REPLEGAMIENTO DE GLICOSILTRANSFERASAS DE MAMÍFERO.

Una proteína GalNAcT2 recombinante, en la que se delecionan una región de anclaje de tallo y un dominio transmembrana de la proteína GalNAcT2 recombinante y en la que se fusiona la proteína GalNAcT2 en el marco con un dominio de unión a maltosa

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2005/003856.

Solicitante: NOVO NORDISK A/S.

Nacionalidad solicitante: Dinamarca.

Dirección: NOVO ALLÉ 2880 BAGSVÄRD DINAMARCA.

Inventor/es: DEFREES, SHAWN, JOHNSON,Karl,F, BEZILA,Daniel,James, SARIBAS,Sami, HAKES,David, WILLETT,Scott.

Fecha de Publicación: 21 de Noviembre de 2011.

Fecha Solicitud PCT: 4 de Febrero de 2005.

Clasificación PCT:

C12N15/00 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K).
C12P1/00 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA. › Preparación de compuestos o de composiciones, no prevista en los grupos C12P 3/00 - C12P 39/00, utilizando microorganismos o enzimas; Procedimientos generales de preparación de compuestos o composiciones que utilizan microorganismos o enzimas.
C12P19/44 C12P […] › C12P 19/00 Preparación de compuestos que contienen radicales sacárido (ácido cetoaldónico C12P 7/58). › Preparación de O-glucósidos, p. ej. glucósidos.
C12Q1/48 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que interviene una transferasa.

Clasificación antigua:

C12N9/10 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › Transferasas (2.) (ribonucleasas C12N 9/22).

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.

PDF original: ES-2368740_T3.pdf

Fragmento de la descripción:

Métodos de replegamiento de glicosiltransferasas de mamífero Campo de la invención La presente invención proporciona métodos de replegamiento de glicosiltransferasas de mamífero que se han producido en células bacterianas, incluyendo mutantes de glicosiltransferasa que tienen una capacidad mejorada para replegarse, y métodos para usar tales glicosiltransferasas replegadas. La invención también proporciona métodos de replegamiento de más de una glicosiltransferasa en un único recipiente, métodos para usar tales glicosiltransferasas replegadas, y mezclas de reacción que comprenden las glicosiltransferasas replegadas. Antecedentes de la invención Los organismos eucariotas sintetizan estructuras de oligosacárido o glicoconjugados, tales como glicolípidos o glicoproteínas, que son comercial y terapéuticamente útiles. La síntesis in vitro de oligosacáridos o glicoconjugados puede llevarse a cabo usando glicosiltransferasas eucariotas recombinantes. El método más eficaz para producir glicosiltransferasas eucariotas recombinantes para la síntesis de oligosacáridos es expresar la proteína en bacterias. Sin embargo, en bacterias, muchas glicosiltransferasas eucariotas se expresan como proteínas insolubles en cuerpos de inclusión bacterianos, y los rendimientos de proteína activa a partir de los cuerpos de inclusión pueden ser muy bajos, Por tanto, existe la necesidad de métodos mejorados para producir glicosiltransferasas eucariotas en bacterias. La presente invención resuelve esta y otras necesidades. Breve sumario de la invención La presente invención proporciona un método de replegamiento de una glicosiltransferasa eucariota, recombinante, insoluble que comprende un dominio de proteína de unión a maltosa (MBD). La glicosiltransferasa eucariota, recombinante, insoluble se solubiliza en un tampón de solubilización y entonces se pone en contacto con un tampón de replegamiento que comprende un par redox, de manera que la glicosiltransferasa eucariota replegada cataliza la transferencia de un azúcar de un sustrato donador a un sustrato aceptor. En una realización, la glicosiltransferasa eucariota se trunca para eliminar la totalidad o una parte de una región de tallo de la proteína. En otra realización, se elimina una cisteína desapareada en la glicosiltransferasa eucariota mediante sustitución por un aminoácido distinto de cisteína. En una realización adicional, se elimina una cisteína desapareada en la glicosiltransferasa eucariota mediante sustitución por un aminoácido distinto de cisteína y la glicosiltransferasa eucariota también se trunca para eliminar la totalidad o una parte de una región de tallo de la proteína. En una realización, la glicosiltransferasa eucariota se selecciona del grupo que consiste en GnT1, GalT1, StIII Gal3, ST3GalI, St6 GalNAcTI, Core GalITI, GalNAcT2. En una realización, la glicosiltransferasa eucariota comprende además un dominio de purificación, por ejemplo, un dominio de unión a almidón (SBD), un dominio de tiorredoxina, un dominio SUMO, un dominio de poli-His, un dominio de epítopo myc y un dominio de glutatión-S-transferasa. En una realización, la glicosiltransferasa eucariota comprende además un dominio de autoescisión. En una realización, la glicosiltransferasa eucariota se expresa en una célula huésped bacteriana como un cuerpo de inclusión insoluble. En una realización, una segunda glicosiltransferasa eucariota recombinante, insoluble se repliega con la primera glicosiltransferasa eucariota. En una realización adicional, una tercera glicosiltransferasa eucariota recombinante, insoluble se repliega con la primera glicosiltransferasa eucariota y la segunda glicosiltransferasa eucariota. Puede añadirse una glicosiltransferasa eucariota recombinante, insoluble adicional y replegarse juntas dependiendo de las necesidades del usuario, por ejemplo, replegamiento de 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 glicosiltransferasas juntas. En una realización, el par redox se selecciona del grupo que consiste en glutatión reducido/glutatión oxidado (GSH/GSSG) y cisteína/cistamina. En una realización, el sustrato aceptor se selecciona de una proteína, un péptido, una glicoproteína y un glicopéptido. En una realización, la glicosiltransferasa eucariota es una sialiltransferasa. Las sialiltransferasas pueden incluir, por ejemplo, StIII Gal3, ST3GalI, St6 GalNAcTI. En un aspecto adicional, el sustrato donador es una molécula de CMPácido siálico-PEG y el sustrato aceptor se selecciona de una proteína, un péptido, una glicoproteína y un glicopéptido. La presente invención también proporciona una glicosiltransferasa eucariota, recombinante, en la que se han delecionado una región de anclaje de tallo y un dominio transmembrana de la proteína, y en el que la glicosiltransferasa se fusiona en el marco con un dominio de proteína de unión a maltosa (MBP). En una realización, 2 la fusión de la glicosiltransferasa eucariota, recombinante y el dominio de MBP se expresa como un cuerpo de inclusión insoluble en bacterias, por ejemplo, E. coli. En una realización, se deleciona la totalidad o una parte de la región de tallo de la glicosiltransferasa eucariota, recombinante. En otra realización, se elimina una cisteína desapareada en la glicosiltransferasa eucariota, recombinante mediante sustitución por un aminoácido distinto de cisteína. En una realización adicional, la glicosiltransferasa eucariota, recombinante es una de las siguientes: una proteína GnT1, una proteína GalT1, una proteína StIIIGal3, una proteína ST3GalI, una proteína St6 GalNAcTI, una proteína Core GalITI o una proteína GalNAcT2. En una realización, la glicosiltransferasa eucariota, recombinante es una proteína GnT1. En un aspecto, la proteína GnT1 es una proteína GnT1 humana truncada seleccionada de GnT1 35 y GnT1103. En otro aspecto, la proteína GnT1 es una proteína GnT1 humana que comprende una sustitución de cisteína desapareada seleccionada del grupo que consiste en CYS121ALA, CYS121ASP y ARG120ALA, CYS121HIS. En un aspecto adicional, la proteína GnT1 tanto está truncada como se le ha eliminado un residuo de cisteína desapareado mediante una mutación por sustitución. En una realización, la glicosiltransferasa eucariota, recombinante es una proteína GalT1. En un aspecto, la proteína GalT1 es una proteína GalT1 bovina truncada seleccionada de GalT1 70 y GalT1 129. En otro aspecto, la proteína GalT1 es una proteína GalT1 bovina que comprende una sustitución de cisteína desapareada de CYS342THR. En un aspecto adicional, la proteína GalT1 tanto está truncada como se le ha eliminado un residuo de cisteína desapareado mediante una mutación por sustitución. En una realización, la glicosiltransferasa eucariota, recombinante es una proteína ST3GalIII. En un aspecto, la proteína ST3GalIII es una proteína ST3GalIII de rata truncada seleccionada de ST3GalIII28, ST3GalIII73, ST3GalIII85 y ST3GalIII86. En otro aspecto, la proteína ST3GalIII comprende una sustitución de aminoácido por un residuo de cisteína desapareado. En un aspecto adicional, la proteína ST3GalIII tanto está truncada como se le ha eliminado un residuo de cisteína desapareado mediante una mutación por sustitución. En una realización, la glicosiltransferasa eucariota, recombinante de la reivindicación 15, en la que la glicosiltransferasa es una proteína Core1 GalT1. En un aspecto, la proteína Core1 GalT1 es una proteína de Drosophila truncada o una proteína humana truncada. En otro aspecto, una proteína Core1 GalT1 humana o de Drosophila comprende una sustitución de aminoácido por un residuo de cisteína desapareado. En un aspecto adicional, una proteína Core1 GalT1 humana o de Drosophila tanto está truncada como se le ha eliminado un residuo de cisteína desapareado mediante una mutación por sustitución. En una realización, la glicosiltransferasa eucariota, recombinante es una proteína ST3Gal1. En un aspecto, la proteína ST3Gal1 es una proteína humana truncada seleccionada de ST3Gal129, ST3Gal145 y ST3Gal156. En otro aspecto, la proteína ST3Gal1 comprende una sustitución de aminoácido por un residuo de cisteína desapareado. En un aspecto adicional, la proteína ST3Gal1 tanto está truncada como se le ha eliminado un residuo de cisteína desapareado mediante una mutación por sustitución. En una realización, la glicosiltransferasa eucariota, recombinante es una proteína ST6GalNAc1. En un aspecto, la proteína ST6GalNAc1 es una proteína de ratón truncada, una proteína de gallina truncada o una proteína humana truncada, por ejemplo, uno de los truncamientos enumerados en la tabla 14. En otro aspecto, una proteína ST6GalNAc1 de ratón, gallina o humana comprende una sustitución de aminoácido por un residuo de cisteína desapareado. En un aspecto adicional, una proteína ST6GalNAc1 de ratón, gallina o humana tanto está truncada como se... [Seguir leyendo]

Reivindicaciones:

1. Una proteína GalNAcT2 recombinante, en la que se delecionan una región de anclaje de tallo y un dominio transmembrana de la proteína GalNAcT2 recombinante y en la que se fusiona la proteína GalNAcT2 en el marco con un dominio de unión a maltosa. 2. La proteína GalNAcT2 recombinante de la reivindicación 1, en la que se deleciona la totalidad o una parte de región de tallo. 3. La proteína GalNAcT2 recombinante de la reivindicación 1, en la que se elimina una cisteína desapareada en la proteína GalNAcT2 recombinante mediante sustitución por aminoácido distinto a cisteína. 4. La proteína GalNAcT2 recombinante de la reivindicación 1, siendo la proteína GalNAcT2 recombinante una proteína GalNAcT2 humana truncada seleccionada de GalNAcT2 40, GalNAcT2 51, GalNAcT2 74 y GalNAcT2 95. 5. Un método de remodelación de una proteína, un péptido, una glicoproteína o un glicopéptido usando la proteína GalNAcT2 recombinante de la reivindicación 1. 6. Un método de replegamiento de una primera glicosiltransferasa eucariota, recombinante, insoluble, en el que la glicosiltransferasa comprende un dominio de proteína de unión a maltosa (MBD), comprendiendo el método las etapas de (a) solubilizar la glicosiltransferasa eucariota, recombinante, insoluble en un tampón de solubilización; y (b) poner en contacto la glicosiltransferasa eucariota soluble con un tampón de replegamiento que comprende un par redox para replegar la glicosiltransferasa eucariota, en el que la glicosiltransferasa eucariota replegada cataliza la transferencia de un azúcar de un sustrato donador a un sustrato aceptor; en el que la primera glicosiltransferasa eucariota es GalNAcT2. 7. El método de la reivindicación 6, en el que la primera glicosiltransferasa eucariota se trunca para eliminar la totalidad o una parte de una región de tallo. 8. El método de la reivindicación 6, en el que se elimina una cisteína desapareada en la primera glicosiltransferasa eucariota mediante sustitución por un aminoácido distinto de cisteína. 9. El método de la reivindicación 6, en el que la primera glicosiltransferasa eucariota comprende además un dominio de purificación seleccionado del grupo que consiste en un dominio de unión a almidón, un dominio de tiorredoxina, un dominio SUMO, un dominio de poli-His, un dominio de epítopo myc y un dominio de glutatión-S-transferasa. 10. El método de la reivindicación 6, en el que la primera glicosiltransferasa eucariota comprende además un dominio de autoescisión. 11. El método de la reivindicación 6, en el que la primera glicosiltransferasa eucariota se expresa en una célula huésped bacteriana como un cuerpo de inclusión insoluble. 12. El método de la reivindicación 6, en el que una segunda glicosiltransferasa eucariota recombinante, insoluble se repliega con la primera glicosiltransferasa eucariota. 13. El método de la reivindicación 12, en el que una tercera glicosiltransferasa eucariota recombinante, insoluble se repliega con la primera glicosiltransferasa eucariota y la segunda glicosiltransferasa eucariota. 14. El método de la reivindicación 6, en el que el par redox se selecciona del grupo que consiste en glutatión reducido/glutatión oxidado (GSH/GSSG) y cisteína/cistamina. 15. El método de la reivindicación 6, en el que el sustrato aceptor se selecciona de una proteína, un péptido, una glicoproteína y un glicopéptido. 53 54 56 57 58 59 61 62 63 64 66 67 68 69 71 72 73 74 76 77 78 79 81 82 83 84 86 87 88 89 91 92 93 94 96 97 98 99 101 102 103 104 106 107

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