MÉTODO Y KIT PARA EL DIAGNÓSTICO DE COLITIS ULCEROSA.
Método para la diferenciación entre colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn basándose en el análisis de perfiles de expresión génica en una o más muestras de biopsia obtenidas a partir de tejido inflamado de los intestinos de un paciente,
caracterizado porque se determinan los niveles de expresión de al menos dos de varios genes marcadores, seleccionándose dichos al menos dos genes marcadores de SLC6A14, SLC26A2, GRO1, MMP-7, MAF-17, GISP y Vanin-1 y en el que - en relación con SLC6A14, la expresión de dicho gen marcador en tejido inflamado se considera una indicación de colitis ulcerosa, - en relación con SLC26A2, la falta de expresión de dicho gen marcador en tejido inflamado se considera una indicación de colitis ulcerosa, - en relación con GRO1, la expresión de dicho gen marcador en tejido inflamado se considera una indicación de colitis ulcerosa, - en relación con MMP-7, la expresión de dicho gen marcador en tejido inflamado se considera una indicación de colitis ulcerosa, - en relación con MAP-17, la expresión de dicho gen marcador en tejido inflamado se considera una indicación de colitis ulcerosa, - en relación con GISP, la expresión preferente de dicho gen marcador en tejido inflamado se considera una indicación de colitis ulcerosa, - en relación con Vanin-1, la expresión de dicho gen marcador en tejido inflamado se considera una indicación de colitis ulcerosa
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/SE2003/001105.
Solicitante: INDEX DIAGNOSTICS AB (PUBL).
Nacionalidad solicitante: Suecia.
Dirección: SCHEELES VAG 1 171 77 STOCKHOLM SUECIA.
Inventor/es: DIECKMANN, ANDREAS, LOFBERG,ROBERT, VON STEIN,OLIVER, VON STEIN,Petra.
Fecha de Publicación: .
Fecha Solicitud PCT: 25 de Junio de 2003.
Clasificación PCT:
- C12Q1/68 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
- G01N33/53 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Ensayos inmunológicos; Ensayos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas; Materiales a este efecto.
Clasificación antigua:
Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.
PDF original: ES-2356599_T3.pdf
Fragmento de la descripción:
Método y kit para el diagnóstico de colitis ulcerosa.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a diagnóstico de enfermedades inflamatorias del intestino, y en particular a un método y un kit para la predicción y/o el diagnóstico de colitis ulcerosa. La invención da a conocer genes marcadores específicos cuyo cambio en el estado de expresión, o bien conjuntamente o bien un subconjunto de los mismos, es indicativo de colitis ulcerosa. La presente invención se refiere además a métodos relacionados con ADN mediante los que la cuantificación de los niveles de expresión de dichos genes marcadores asociados con la enfermedad directamente a partir de una biopsia proporciona una prueba de diagnóstico inmediata y precisa para determinar el tipo de enfermedad, y/o la evaluación del efecto de un régimen de tratamiento particular. La invención da a conocer además kits de diagnóstico para la detección de los niveles de expresión de dichos genes.
Antecedentes de la invención
Enfermedad inflamatoria del intestino (EII) es una expresión que abarca varios estados que implican inflamación crónica en el sistema gastrointestinal. Dos de las formas más debilitantes de EII son la colitis ulcerosa (CU) y la enfermedad de Crohn (EC). Estas enfermedades afectan a personas jóvenes, con una aparición típica a la edad de 20-30 años, y el tratamiento de la enfermedad es un compromiso a largo plazo tanto para el paciente como para el médico, puesto que en la actualidad no existe cura para ninguno de los estados. Aproximadamente el 30% de los pacientes con EII se someten a cirugía durante su vida y los pacientes con EII de larga duración corren un riesgo considerable de desarrollar cáncer colorrectal. Tres de cada diez pacientes con EII no responden a la mejor terapia médica disponible hoy en día, incluso cuando se usan dosis altas, que provocan efectos secundarios considerables.
El tratamiento de los pacientes con CU activa está dirigido a reducir la inflamación y a promover la curación del colon y la recuperación de la mucosa. La causa subyacente de CU no se comprende, ni se sabe qué desencadena que la enfermedad se repita entre sus formas inactiva y activa. Sin embargo, el estadio activo de la enfermedad se caracteriza por una inflamación significativa de la mucosa, un aumento de la permeabilidad celular, una pérdida de proteína y fluidos. En estadios graves, la inflamación profunda de la pared intestinal puede desarrollarse con dolor con la exploración abdominal, taquicardia, fiebre y riesgo de perforación intestinal.
Un síntoma temprano de la colitis ulcerosa es estreñimiento con paso de sangre o mucosidad a las heces. Pueden pasar varios meses o años antes de que se desarrolle diarrea con dolor abdominal. Los síntomas tardíos incluyen fatiga intensa, pérdida de peso, pérdida del apetito, fiebre y ocasionalmente artralgia.
El camino hacia un diagnóstico de colitis ulcerosa establecido incluye con frecuencia un estudio meticuloso de la historia clínica del paciente, la exclusión de otros estados, así como varias pruebas, por ejemplo análisis de sangre, examen de las heces, rayos X con enema de bario, sigmoidoscopia, colonoscopia y biopsia. La biopsia puede realizarse como parte de un examen mediante sigmoidoscopia o colonoscopia.
Es obvio que una posibilidad de distinguir clínicamente CU de EC del colon en un estadio temprano proporcionaría enormes beneficios tanto para el paciente como para el médico. Permitiría diseñar regímenes de tratamiento precisos, evitar medicaciones innecesarias y reducir los costes del tratamiento. Aunque el cuadro clínico global en pacientes con EII pueda mostrar algunas diferencias clínicamente importantes entre los principales grupos de pacientes con CU y EC, existen similitudes sustanciales, haciéndose así difícil para el personal sanitario establecer un diagnóstico correcto.
Técnica anterior
La técnica anterior indica que los métodos disponibles para distinguir entre las formas de EII, y en particular la diferenciación entre CU y EC, aparte de los ejemplos dados anteriormente de diferentes procedimientos de examen, se han centrado en métodos basados en anticuerpos.
Por ejemplo, el documento WO 03/036262 describe un método y aparato para la diferenciación de enfermedad de Crohn de otras afecciones gastrointestinales, tales como colitis ulcerosa y síndrome del intestino irritable, usando la presencia de anticuerpos anti-Saccharomyces cerevisiae (ASCA) fecales como marcador para la enfermedad de Crohn. El aparato incluye un inmunoensayo ligado a enzimas u otro inmunoensayo que utiliza anticuerpos específicos frente a inmunoglobulinas humanas para la medición de los ASCA endógenos totales en una muestra fecal humana. El método y aparato pueden usarse por los profesionales sanitarios para distinguir la enfermedad de Crohn de otras afecciones gastrointestinales, tales como colitis ulcerosa y síndrome del intestino irritable.
El documento WO 01/58927 describe métodos de diagnóstico para detectar enfermedades asociadas con una respuesta autoantigénica frente a hTM en tejido afectado, y en particular colitis ulcerosa.
Sigue existiendo una necesidad de métodos mejorados para el diagnóstico preciso, rápido y fiable de la colitis ulcerosa, en particular en el contexto de distinguir entre colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn en pacientes con EII.
Un objetivo de la presente invención es hacer disponibles tales métodos y kits para este fin. Un objetivo particular es hacer disponible un método y un kit que hagan posible alcanzar un diagnóstico fiable en un estadio temprano de la enfermedad. Otro objetivo es hacer posible distinguir entre EC y CU también en casos difíciles, en los que el cuadro ciánico puede ser muy similar.
Objetivos adicionales que subyacen a la invención, así como las soluciones ofrecidas por la invención y las ventajas asociadas resultarán evidentes para un experto tras el estudio de la descripción, los ejemplos y las reivindicaciones.
Sumario de la invención
Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que la diferenciación entre colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn se hace posible mediante un enfoque de múltiples genes en el que se estudian los perfiles de expresión génica en muestras de biopsia obtenidas a partir de zonas inflamadas y opcionalmente también no inflamadas en los intestinos de un paciente.
La presente invención se basa en el descubrimiento de posibles genes marcadores que, o bien conjuntamente o bien en subgrupos, son indicativos del estado humano de colitis ulcerosa (CU). Los presentes inventores descubrieron sorprendentemente que la cuantificación de los niveles de expresión de varios genes específicos puede utilizarse para diagnosticar de manera precisa y sencilla a partir de una biopsia, si el paciente está aquejado del estado de CU o, por ejemplo, enfermedad de Crohn.
Más específicamente, se proporcionan métodos que permiten la amplificación de ácido nucleico de siete (7) marcadores genéticos diferenciados o subgrupos de los mismos, usando cebadores específicos de gen preseleccionados que permiten la semicuantificación de los niveles de expresión de dichos marcadores genéticos. Se determinan los niveles de expresión de al menos dos de los marcadores genéticos seleccionados de SLC6A14, SLC26A2, GRO1, MMP-7, MAP-17, GISP y Vanin-1. Los cebadores específicos de gen están diseñados para hibridarse con cadenas opuestas del ADN que codifica para el marcador genético de interés de manera que a través de amplificación por PCR se produce una región definida del ADN codificante del gen de marcador genético. Se proporcionan un ensayo y un kit para la detección y monitorización del estado de expresión de dichos siete genes marcadores o subconjuntos de los mismos en una muestra biológica. El ensayo es un ensayo basado en PCR, no en cultivo, para la detección de dichos genes marcadores.
Breve descripción de los dibujos
La presente invención se describirá en mayor detalle en la siguiente descripción y ejemplos, con referencia a los dibujos en los que
La figura 1 muestra el análisis por RT-PCR del estado de expresión de siete genes marcadores en muestras de biopsia de pacientes aquejados de o bien colitis ulcerosa (CU) o bien de enfermedad de Crohn (EC). El protocolo experimental se resume en el ejemplo 6. (Claves: M, es un marcador de pares de bases, H, representa una biopsia de un individuo sano totalmente normal, I, representa una... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Método para la diferenciación entre colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn basándose en el análisis de perfiles de expresión génica en una o más muestras de biopsia obtenidas a partir de tejido inflamado de los intestinos de un paciente, caracterizado porque se determinan los niveles de expresión de al menos dos de varios genes marcadores, seleccionándose dichos al menos dos genes marcadores de SLC6A14, SLC26A2, GRO1, MMP-7, MAF-17, GISP y Vanin-1 y en el que
2. Método según la reivindicación 1, en el que:
3. Método según la reivindicación 1, en el que también se obtiene una muestra a partir de tejido no inflamado de los intestinos del paciente y en el que:
4. Método según la reivindicación 1, en el que se determinan los niveles de expresión de SLC6A14 y SLC26A2 y en el que la expresión de SLC6A14 en tejido inflamado junto con la falta de expresión de SLC26A2 en tejido inflamado, se considera una indicación de colitis ulcerosa.
5. Método según las reivindicaciones 1 y 3, en el que se determinan los niveles de expresión de SLC6A14 y SLC26A2 y en el que la expresión de SLC6A14 en tejido inflamado y la falta de expresión en tejido no inflamado, junto con la falta de expresión de SLC26A2 en tejido inflamado o la expresión preferente en tejido no inflamado, se considera una indicación de colitis ulcerosa.
6. Método según la reivindicación 1, en el que la muestra es una muestra de biopsia, y se determinan los niveles de expresión de SLC6A14, SLC26A2 y GRO1, y en el que la expresión de SLC6A14 en tejido inflamado junto con la falta de expresión de SLC26A2 en tejido inflamado, y la expresión de GRO1 en tejido inflamado, se considera una indicación de colitis ulcerosa.
7. Método según las reivindicaciones 1 y 3, en el que se determinan los niveles de expresión de SLC6A14, SLC26A2 y GRO1, y en el que la expresión de SLC6A14 en tejido inflamado y la falta de expresión en tejido no inflamado, junto con la falta de expresión de SLC26A2 en tejido inflamado, o la expresión preferente en tejido no inflamado, y la expresión de GRO1 en tejido inflamado y la falta de expresión en tejido no inflamado, se considera una indicación de colitis ulcerosa.
8. Método según la reivindicación 1, en el que la muestra es una muestra de biopsia, y se determinan los niveles de expresión de S1C6A14, SLC26A2 y MMP-7, y en el que la expresión de SLC6A14 en tejido inflamado, junto con la falta de expresión de SLC26A2 en tejido inflamado, y la expresión de MMP-7 en tejido inflamado, se considera una indicación de colitis ulcerosa.
9. Método según las reivindicaciones 1 y 3, en el que se determinan los niveles de expresión de SLC6A14, SLC26A2 y MMP-7, y en el que la expresión de SLC6A14 en tejido inflamado y la falta de expresión en tejido no inflamado, junto con la falta de expresión de SLC26A2 en tejido inflamado, o la expresión preferente en tejido no inflamado, y la expresión de MMP-7 en tejido inflamado y la falta de expresión en tejido no inflamado, se considera una indicación de colitis ulcerosa.
10. Método según la reivindicación 1, en el que la muestra es una muestra de biopsia, y se determinan los niveles de expresión de SLC6A14, SLC26A2, GRO1, MMP-7, MAP-17, GISP y Vanin-1, y en el que la expresión de SLC6A14, GRO1, MMP-7, MAP-17, GISP y Vanin-1 en tejido inflamado o la expresión preferente en tejido inflamado, junto con la falta de expresión de SLC26A2 en tejido inflamado, se considera una indicación de colitis ulcerosa.
11. Método según las reivindicaciones 1 y 3, en el que se determinan los niveles de expresión de SLC6A14, SLC26A2, GRO1, MMP-7, MAP-17, GISP y Vanin-1, y en el que la expresión de SLC6A14, GRO1, MMP-7, MAP-17, GISP y Vanin-1 en tejido inflamado o la expresión preferente en tejido inflamado, y la falta de expresión en tejido no inflamado, junto con la falta de expresión de SLC26A2 en tejido inflamado, o la expresión preferente en tejido no inflamado, se considera una indicación de colitis ulcerosa.
12. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el nivel de expresión de cada gen marcador se determina a través de amplificación de ácido nucleico de dichos genes usando cebadores específicos de gen, y determinación de los resultados de amplificación.
13. Método según la reivindicación 12, en el que la amplificación de ácido nucleico se realiza usando PCR y los cebadores específicos de gen seleccionados de SEQ.ID.NO. 13-26.
14. Kit para la diferenciación entre colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn basándose en el análisis de perfiles de expresión génica en muestras obtenidas a partir de los intestinos de un paciente, caracterizado porque dicho kit incluye pares de cebadores específicos de gen dirigidos a al menos dos genes marcadores seleccionados de SLC6A14, SLC26A2, GRO1, MMP-7, MAP-17, GISP y Vanin-1 y en el que dichos pares de cebadores específicos de gen se seleccionan de SEQ.ID.NO. 13 y SEQ.ID.NO. 14; SEQ.ID.NO. 15 y SEQ.ID.NO. 16; SEQ.ID.NO. 17 y SEQ.ID.NO. 18; SEQ.ID.NO. 19 y SEQ.ID.NO. 20; SEQ.ID.NO. 21 y SEQ.ID.NO. 22; SEQ.ID.NO. 23 y SEQ.ID.NO. 24; y SEQ.ID.NO. 25 y SEQ.ID.NO. 26 o pares de cebadores funcionalmente equivalentes específicos para los mismos genes marcadores.
15. Kit según la reivindicación 14, en el que dichos cebadores específicos son SEQ.ID.NO. 13 y SEQ.ID.NO. 14; SEQ.ID.NO. 15 y SEQ.ID.NO. 16; y SEQ.ID.NO. 17 y SEQ.ID.NO. 18.
16. Kit según la reivindicación 14, en el que dichos cebadores específicos son SEQ.ID.NO. 13 y SEQ.ID.NO. 14; SEQ.ID.NO. 15 y SEQ.ID.NO. 16; y SEQ.ID.NO. 19 y SEQ.ID.NO. 20.
17. Kit según una cualquiera de las reivindicaciones 14-16, que comprende además un agente de polimerización termoestable y cofactor(es) requerido(s).
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