METODO Y KIT DE ENSAYO IN VITRO PARA EL ESTUDIO DE LOS EFECTOS DEL TRATAMIENTO CRONICO CON SUSTANCIAS SOBRE CULTIVOS CELULARES.

Método y kit de ensayo in vitro para el estudio de los efectos del tratamiento crónico con sustancias sobre cultivos celulares. Campo técnico de la invención La presente invención se refiere a un método y un kit de ensayo in vitro para el estudio del tratamiento crónico con sustancias de origen natural o sintético y de su efecto sobre cultivos celulares. Por lo tanto, la presente invención puede englobarse dentro del campo de la toxicología, industria farmacéutica, química, cosmética o biotecnología. Estado de la técnica Los estudios de toxicidad constituyen hoy día una parte muy importante dentro del desarrollo de nuevos fármacos y se extienden prácticamente a lo largo de todo el proceso de desarrollo del nuevo fármaco. El objetivo de dichos estudios es evaluar el riesgo o peligro potencial que un agente químico o físico puede ocasionar sobre la salud humana cuando es objeto de exposiciones agudas o crónicas. Y no se limitan sólo a los fármacos sino que la mayor parte de las sustancias químicas industriales (pesticidas, agroquímicos, cosméticos, plásticos, etc.) son objeto de estudios de toxicidad iguales o más complejos que los realizados con los nuevos fármacos. Podría definirse la toxicidad como el estudio cualitativo y cuantitativo de los efectos deletéreos ocasionados por agentes químicos o físicos sobre la estructura y función de los sistemas vivos y la aplicación de estos estudios para la evaluación de la seguridad y la prevención de daños al hombre y a las formas de vida útiles. El término cualitativo se refiere al tipo de órgano diana afectado, en comparación con otras sustancias conocidas, mientras que el término cuantitativo se refiere a la relación dosis-respuesta. La toxicidad aguda de un candidato a fármaco, o de cualquier otro tipo de molécula a la que pueda resultar expuesto un organismo, suele ser fácilmente detectable in vitro. Por el contrario, la toxicidad crónica, o sostenida, resulta más difícil de predecir y, sin embargo, su detección es un aspecto importante de la investigación preclínica (conjunto de estudios de laboratorio: físico-químicos, toxicológicos y farmacológicos) (1-3). Los procedimientos normativos (FDA -Administración de alimentos y fármacos; OCDE-Organización para la cooperación y el Desarrollo Económico; etc.) para la aceptación y futura puesta en el mercado del posible fármaco, implican la administración repetida de dicho futuro fármaco a dos especies animales (roedor y no roedor) durante un período de al menos tres meses, mientras que el análisis de carcinogenicidad implica la administración del futuro fármaco durante toda la vida del animal (4). Este tipo de ensayos in vivo requiere el sacrificio y el control estricto de un gran número de animales de experimentación (con las implicaciones éticas y económicas que ello conlleva), consumen mucho tiempo y no siempre son predictivos de la toxicidad de dichos compuestos en la especie humana. A pesar de los significativos esfuerzos en los últimos años para desarrollar ensayos fiables órgano-específicos in vitro, entre los que destacan los órganos aislados perfundidos, los cortes de órganos y los cultivos celulares primarios y permanentes (5), la disponibilidad de tests fiables para la predicción de la toxicidad crónica todavía es muy limitada. Por ello, se precisan con urgencia modelos in vitro, perfectamente estandarizados, para la evaluación de la toxicidad crónica y sub-crónica de fármacos y xenobióticos (compuestos externos a un organismo vivo que interaccionan con él, generalmente a través de alteraciones metabólicas). Una de las razones que dificultan el desarrollo de modelos in vitro de toxicidad crónica es la inherente limitación temporal de la exposición al agente tóxico en la mayor parte de los sistemas celulares in vitro convencionales disponibles, como consecuencia de la elevada tasa de crecimiento de los mismos (líneas celulares establecidas) o la dificultad de mantener una fase de confluencia estática y estable durante muchos días (líneas celulares y cultivos primarios). En el pasado se ha intentado obviar esta dificultad del diseño de los modelos celulares mediante diferentes tipos fundamentales de estrategia experimental (1-3): a) Uso de biorreactores, técnicamente complejos y de elevado coste económico. En concreto, se han evaluado dos tipos de biorreactor: un biorreactor de flujo, basado en tecnología de fibra hueca (Technomouse) y un biorreactor estático, basado en membranas semipermeables (CELLine CL-6), aunque sólo el biorreactor estático permitía un uso eficiente para desarrollar estudios de citotoxicidad crónica (6). b) Uso de sistemas convencionales de cultivo estático en los que las sustancias en estudio crónico se deben de añadir repetidamente, tras proceder a cambios periódicos de los medios de cultivo o al subcultivo de las células. En muchos casos, los cultivos se realizan en condiciones complejas, con la creación de matrices tridimensionales, adición de materiales complejos de soporte, artificiales o biológicos, que pueden contener impurezas en forma de factores de crecimiento o sustancias no definidas. c) Uso de cultivos no estáticos, como los cultivos en rotación o en perfusión, en los que se somete a las células a estrés mecánico (cultivos en rotación o agitación) o que requieren grandes cantidades de medio de cultivo, células y reactivos (cultivos en perfusión), complican el control metabólico, y limitan su aplicabilidad a estudios extensos, por ejemplo, de cribado (1-3). 2 ES 2 350 072 A1 d) Determinación de parámetros tempranos de lesión celular in vitro como predictores de toxicidad crónica en el organismo vivo. Esta estrategia se centra principalmente en el estudio específico de los fenómenos tóxicos hepáticos y renales, por la importancia intrínseca de estos tejidos como diana y moduladores de la toxicidad de numerosas sustancias tóxicas y xenobióticos. De acuerdo a los comentarios anteriores,y en el contexto del análisis toxicológico que pudiéramos denominar de alto rendimiento, es decir dirigido a evaluar los efectos sostenidos de una gran cantidad de productos químicos, como requiere la futura normativa europea (7) o de moléculas candidatas en farmacología, resulta evidente el interés de disponer de modelos celulares de toxicidad crónica o sostenida que sean sensibles, sencillos, reproducibles, aplicables a diversos modelos celulares (cultivos primarios y líneas celulares establecidas) y de bajo coste económico. Este propósito, se debería alcanzar a través de: a) La disponibilidad de sistemas alternativos de cultivo celular que permitan prolongadas exposiciones a un xenobiótico de la misma población celular en fase quiescente b) La disponibilidad de procedimientos analíticos que permitan detectar de forma sensible y multiparamétrica alteraciones celulares y moleculares inducidas por la exposición sostenida a agentes tóxicos. Idealmente, tales métodos deberían proporcionar capacidad de resolución temporal (es decir, poder distinguir fenómenos tempranos, transitorios y tardíos), resolución poblacional (es decir, poder detectar fenómenos que afecten a subpoblaciones minoritarias dentro de una población mayoritariamente no afectada y caracterizar el fenotipo de las poblaciones sensibles o resistentes) y resolución mecanística (es decir, identificar o sugerir las posibles dianas moleculares de la acción tóxica de los xenobióticos). En este sentido, la citómica, o citometría de sistemas complejos, es una disciplina que se orienta a la investigación molecular en células individuales y que permite acceder a múltiples características bioquímicas de los sistemas celulares heterogéneos (http://www.uv.es/cytomics). La capacidad única de estudiar de esta forma sistemas celulares complejos, en condiciones similares a su situación fisiológica o patológica in vivo, ha conducido al desarrollo del concepto de medicina predictiva basada en la Citómica (8-10). La información sobre el futuro desarrollo de una enfermedad en un paciente individual supone una importante adición al concepto actual de evaluación pronostica de una enfermedad basada en la estadística, cuya representación más conocida son las curvas de Kaplan-Meier y que suele ser insuficiente para establecer un patrón terapéutico individual. Es evidente que la extrapolación de la capacidad predictiva de la citómica al campo de la investigación de los efectos celulares de fármacos y xenobióticos, incluyendo la predicción de toxicidad, es, cuando menos, muy sugerente. El progreso de la Citómica ha sido posible por la evolución de las tecnologías de análisis celular individual, fundamentalmente la citometría de flujo y la microscopía confocal y de barrido láser (11-13). La aplicación de las técnicas citómicas puede generar matrices de datos de alto contenido.... [Seguir leyendo]

1. Método de ensayo in vitro para el estudio de los efectos del tratamiento crónico de sustancias sobre cultivos celulares que comprende las etapas de: a) Siembra de células en un contenedor hermético. b) Crecimiento del cultivo c) Poner en contacto el cultivo celular con la/s sustancia/s de estudio durante un tiempo determinado. d) Extraer la suspensión celular del contenedor hermético y hacer alícuotas de la misma. e) Añadir a las alícuotas del paso d) fluorocromos a las concentraciones óptimas. f) Incubar las alícuotas con los fluorocromos del paso e) en oscuridad. g) Analizar las alícuotas del paso f) mediante monitorización in situ y posteriormente cuantificar mediante ensayos citométricos, los efectos del tratamiento crónico con las sustancias de estudio de los cultivos in vitro. 2. Método según la reivindicación 1 caracterizado porque las sustancias utilizadas se seleccionan entre: tóxicos, fármacos, xenobióticos, contaminantes atmosféricos, cosméticos, sustancias líquidas o gaseosas, nanomateriales y moléculas biológicas. 3. Método según la reivindicación 1 caracterizado porque los cultivos celulares se seleccionan entre líneas celulares establecidas de origen humano o animal y cultivos primarios de origen humano y animal que pueden crecer en forma de monocapa o de suspensión celular. 4. Método según la reivindicación 3 caracterizado porque las líneas y cultivos celulares que crecen en monocapa lo hacen sobre la superficie apta para el cultivo de contenedores herméticos. 5. Método según la reivindicación 3 caracterizado porque las líneas y cultivos celulares que crecen en suspensión en los contenedores herméticos se mantienen de forma continua en agitación o rotación orbital. 6. Método según la reivindicación 1 caracterizado porque el tiempo que se mantiene en contacto la sustancia y el cultivo celular es preferentemente un mínimo de 72 horas. 7. Método según la reivindicación 1 caracterizado porque la extracción de la suspensión celular del paso d) si los cultivos celulares crecen en forma de monocapa comprende las etapas de: 7.1) Extraer de manera estéril el medio de cultivo del contenedor hermético y conservarlo en condiciones estériles. 7.2) Levantar las células de las paredes del contenedor hermético. 7.3) Reintroducir en el contenedor hermético el medio extraído en el paso 7.1) y resuspender las células en el mismo. 8. Método según la reivindicación 7 caracterizado porque para la realización del paso 7.2) se utilizan medios adecuados que se seleccionan entre: tripsina, soluciones que contienen enzimas proteolíticas, soluciones salinas libres de calcio u otros medios. 9. Método según la reivindicación 1 caracterizado porque la extracción de la suspensión celular del paso d) si los cultivos celulares crecen en suspensión comprende las etapas de: 9.1) Extraer de manera estéril el medio de cultivo junto con la suspensión celular del contenedor hermético y conservarlo en condiciones estériles. 9.2) Centrifugar la suspensión celular junto con el medio de cultivo del paso 9.1) 9.3) Desechar el medio de cultivo del paso 9.2) y resuspender en medio de cultivo estéril el agregado celular obtenido después de la centrifugación. 14 ES 2 350 072 A1 10. Método según la reivindicación 1 caracterizado porque los fluorocromos utilizados son cualquier molécula fluorescente capaz de ser medida y cuantificada mediante microscopía de fluorescencia o citometría de flujo, siendo preferentemente: IP, Mitox, H2DCF, DiBac y TMRM. 11. Método según la reivindicación 1 caracterizado porque la monitorización in situ realizada en el paso g) se realiza preferentemente mediante microscopía óptica o de fluorescencia. 12. Método según la reivindicación 1 caracterizado porque los ensayos citométricos se realizan preferentemente mediante citometría de flujo. 13. Método según la reivindicación 1 caracterizado porque los efectos del tratamiento crónico con sustancias que se analizan y cuantifican en el paso g) se seleccionan entre: características morfológicas de las células, formación de micronúcleos, supervivencia celular, muerte celular por apoptosis y/o necrosis, producción de daño oxidativo al DNA nuclear y mitocondrial, niveles intracelulares de ión calcio, potencial de membrana mitocondrial, cantidad de mitocondrias por célula, generación intracelular de ión superóxido, generación intracelular de peróxidos, niveles intracelulares de lípidos apolares, polares, fosfolípidos, lípidos oxidados y colesterol. 14. Método según la reivindicación 1 caracterizado porque la etapa b) puede llevarse a cabo con o sin, una fuente externa de CO2. 15. Método según la reivindicación 1 caracterizado porque la etapa b) puede llevarse a cabo en presencia o no, de humedad. 16. Método según la reivindicación 1 caracterizado porque el cultivo celular en contacto con la/s sustancia/s de estudio puede mantenerse en estado proliferante, diferenciado o en ambos. 17. Método según la reivindicación 1 caracterizado porque se pueden co-cultivar al menos dos líneas celulares, en un mismo contenedor. 18. Método según la reivindicación 17 caracterizado porque las líneas que se pueden co-cultivar se seleccionan entre líneas celulares establecidas de origen humano o animal y cultivos primarios de origen humano y animal, que pueden crecer en forma de monocapa o de suspensión celular. 19. Método según la reivindicación 18 caracterizado porque las líneas y cultivos celulares que crecen en monocapa lo hacen sobre la superficie apta para el cultivo de contenedores herméticos. 20. Método según la reivindicación 18 caracterizado porque las líneas y cultivos celulares que crecen en suspensión en los contenedores herméticos se mantienen de forma continua en agitación o rotación orbital. 21. Método según la reivindicación 1 caracterizado porque los cultivos del paso b) pueden ser mantenidos en hibernación durante un periodo de hasta 3 meses. 22. Método según la reivindicación 21 caracterizado porque la hibernación se consigue preferentemente a una temperatura de entre 20-25ºC. 23. Método según las reivindicaciones 21 y 22 caracterizado porque las células en hibernación pueden volver a fase de crecimiento modificando la temperatura de cultivo a 37ºC. 24. Método según la reivindicación 21 caracterizado porque las células en hibernación pueden ser subcultivadas. 25. Kit de ensayo para llevar a cabo el método de las reivindicaciones 1 a 24 que comprende: i) Un contenedor hermético para siembra y cultivo de células en su interior, que permite el contacto de dichas células con la sustancia cuyo efecto se pretende ensayar. ii) Medios para introducir/extraer en condiciones estériles el medio de cultivo y/o las células del contenedor hermético. iii) Medios para hacer alícuotas del medio y/o las células extraídas del contenedor hermético. iv) Medios para añadir los fluorocromos a las alícuotas. v) Incubación en oscuridad. vi) Medios de monitorización in situ y posterior cuantificación mediante ensayos citométricos. ES 2 350 072 A1 16 ES 2 350 072 A1 17 ES 2 350 072 A1 18 ES 2 350 072 A1 19 ES 2 350 072 A1 ES 2 350 072 A1 21 ES 2 350 072 A1 22 ES 2 350 072 A1 23 ES 2 350 072 A1 24 ES 2 350 072 A1 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA