METODO PARA REGISTRAR VARIACIONES EN LA CAPACIDAD DE MEMBRANA GENERADAS POR VARIACIONES EN EL POTENCIAL DE MEMBRANA CELULAR.
La presente invención se relaciona con un método para la caracterización de los mecanismos de secreción celular en respuesta a estímulos despolarizantes consistente en determinar la capacidad de membrana (Cm) en modo de fijación de voltaje,
cambiar rápidamente las células a modo de fijación de corriente y aplicar dicho estímulo y determinar la Cm de la célula en modo nuevamente de fijación de voltaje en donde la diferencia entre el valor final e inicial de Cm es una medida de la respuesta exocitótica de la célula
Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200701919.
Solicitante: UNIVERSIDAD AUTONOMA DE MADRID.
Nacionalidad solicitante: España.
Provincia: MADRID.
Inventor/es: PEREZ ALVAREZ,ALBERTO, ALBILLOS MARTINEZ,ALMUDENA.
Fecha de Solicitud: 4 de Julio de 2007.
Fecha de Publicación: .
Fecha de Concesión: 31 de Agosto de 2011.
Clasificación Internacional de Patentes:
- G01N33/483 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Análisis físico de material biológico.
Clasificación PCT:
- G01N33/483 G01N 33/00 […] › Análisis físico de material biológico.
PDF original: ES-2338727_B1.pdf
Fragmento de la descripción:
Método para registrar variaciones en la capacidad de membrana generadas por variaciones en el potencial de membrana celular.
Campo técnico de la invención
La presente invención se encuadra dentro del campo de la electrofisiología y más concretamente, se relaciona con un método para registrar los eventos eléctricos y secretores que suceden en células excitables como las neuronas de una manera que refleje fielmente los acontecimientos que ocurren in vivo.
Antecedentes de la invención
El proceso de secreción regulada acoplada a estímulo es un proceso que implica la liberación de sustancias de los gránulos de almacenamiento intracelulares en respuesta a un estímulo despolarizante. El estímulo despolarizante provoca un aumento rápido en la concentración intracelular de calcio, lo que a su vez activa la maquinaria necesaria para la fusión de los gránulos de secreción con el interior de la membrana plasmática y la consiguiente liberación de su contenido al medio extracelular (Garcia et al., 2006; Physiol Rev. 2006; 86:1093-131, Sorensen, J. (Trends Neurosci. 2005 Sep; 28(9):453-455) y Sorensen, J. (Pflugers Arch. 2004 Jul; 448(4):347-62).
Tradicionalmente, el estudio de los procesos de secreción regulada se ha llevado a cabo mediante la detección por medio de técnicas de amperometría de la oxidación de las sustancias liberadas por las células excitadas (Wightman et al., 1991, Proc Natl Acad Sci U S A 88, 10754-10758). Sin embargo, una mayor resolución se consigue mediante la técnica de patch clamp (Hamill et al., 1981, Pflugers Arch 391, 85-100). Esta técnica permite registrar con alta resolución y fiabilidad la corriente iónica que fluye a través de la membrana celular y su potencial en una única célula. Esta técnica incrementó su desarrollo para poder registrar la capacidad de membrana (Cm) (Neher, E. y Marty, A. Proc Natl Acad Sci U S A, 1982, 79, 6712-6716), que es una medida directa de la fusión de vesículas secretoras a la membrana celular y, por tanto, de la secreción.
Sin embargo, la técnica de patch-clamp está limitada porque no es posible medir simultáneamente el potencial de membrana y la corriente iónica, sino que es necesario fijar el potencial de membrana en el primer caso (modo "voltage clamp"), o la corriente en el segundo caso (modo "current clamp"). El modo de fijación de voltaje permite registrar la corriente que pasa a través de la membrana sin que se produzca una variación en el potencial de membrana que afectaría a la corriente, y ver la secreción asociada a ésta (Mollard et al., 1995, Proc Natl Acad Sci U S A 92, 3065-3069). Sin embargo, a la hora de estudiar una respuesta fisiológica, esto representa una limitación puesto que imposibilita la existencia de un potencial libre de membrana. En la respuesta fisiológica, el potencial juega un papel decisivo en la regulación de los procesos estimuladores a los que se ven sometidas las células excitables. El potencial de membrana es el responsable de la apertura, cierre y/o inactivación de canales iónicos dependientes de voltaje, los cuales regulan el trasiego de iones a través de la membrana plasmática, y además modula la fuerza electromotriz de este mencionado flujo. Por todo ello, hasta la fecha no ha sido posible monitorizar la fusión de vesículas a la membrana a través de variaciones en Cm cuando se produce un estímulo en el modo de fijación de corriente. Además, la actividad de los canales iónicos responsables de la corriente iónica y, por tanto, de la despolarización, depende en gran medida del potencial de membrana por lo que, en ausencia de despolarización, el comportamiento exocitótico de la célula no va a reflejar la respuesta fisiológica. En el caso particular de las células cromafines, un problema adicional resulta del hecho de que el aumento de calcio intracelular resulta de la apertura del canal iónico que forma parte del receptor de acetilcolina que es parcialmente permeable a calcio cuando se encuentra activado, pero también resulta de la apertura de los canales de calcio dependientes de voltaje (CCDV) que se activan solamente cuando la membrana se ha despolarizado. En las condiciones en las que se fija un voltaje constante similar al potencial de reposo, la membrana no está despolarizada y, por tanto, no se produce la apertura de los CCDV, por lo que sólo podremos medir la contribución a la respuesta exocitótica del calcio que ha entrado a través del receptor de acetilcolina y no a través de los CCDV.
Polo-Parada, L. et al. (Neuroscience 2006, 143:445-449) describen un método para evaluar la contribución de los distintos CCDV a la exocitosis de catecolaminas en células cromafines. Sin embargo, este método está basado en la variación del potencial de membrana (en el modo de fijación de voltaje) de células cromafines usando potenciales sinusoidales de distinta intensidad que no reflejan la situación fisiológica donde el potencial de membrana varía de forma continua, lo que modularía la entrada de calcio al citosol afectando a la corriente de entrada que fluye a través de canales dependientes de voltaje y por el receptor nicotínico.
Por tanto, existe una necesidad de métodos para el estudio de la respuesta exocitótica a un estímulo que reflejen más fielmente la situación fisiológica.
Compendio de la invención
En un primer aspecto, la invención se relaciona con un método para medir la respuesta exocitótica de una célula a un estímulo despolarizante que comprende las etapas de
en donde el valor de la diferencia entre los valores C2 y C1 es una medida de la respuesta exocitótica de la célula.
En un segundo aspecto, la invención se relaciona con un método para medir el efecto de la despolarización de membrana en una célula sobre la respuesta exocitótica de dicha célula a un estímulo despolarizante que comprende las etapas de
en donde un valor positivo de la diferencia (C4-C3)-(C2-C1) indica que al menos parte de la respuesta exocitótica de la célula al estímulo requiere de la despolarización de la membrana.
En un tercer aspecto, la invención se relaciona con un método para la identificación de inhibidores o activadores de la secreción en respuesta a un estímulo despolarizante que comprende las etapas de
en donde un valor de la diferencia entre C2 y C1 menor que el valor de dicha diferencia obtenido en ausencia de dicho compuesto indica que el compuesto es inhibidor o activador de la secreción en respuesta al estímulo despolarizante y donde un valor de la diferencia entre C2 y C1... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Un método para medir la respuesta exocitótica de una célula a un estímulo despolarizante que comprende las etapas de
en donde el valor de la diferencia entre los valores C2 y C1 es una medida de la respuesta exocitótica de la célula.
2. Un método según la reivindicación 1 en el que la transición entre las etapas a y b y/o entre las etapas b y c se efectúa en el orden de milisegundos.
3. Un método para medir el efecto de la despolarización de membrana en una célula sobre la respuesta exocitótica de dicha célula a un estímulo despolarizante que comprende las etapas de
en donde un valor positivo de la diferencia (C4-C3) - (C2-C1) indica que al menos parte de la respuesta exocitótica de la célula al estímulo requiere de la despolarización de la membrana.
4. Un método según las reivindicación 2 en el que la transición entre las etapas c y d y/o entre las etapas d y e se efectúa en el orden de milisegundos.
5. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el que el estímulo despolarizante se selecciona del grupo de un ligando capaz de provocar la apertura de un canal iónico, un ligando capaz de provocar un trasiego iónico a través de la membrana de la célula y una inyección de corriente que genere un potencial de acción en el modo de fijación de corriente.
6. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la aplicación del ligando se realiza de manera ultracorta, preferiblemente del orden de milisegundos, y/o repetitiva, preferiblemente con una frecuencia de 0.1 a 100 Hertzios.
7. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la célula se selecciona del grupo de una célula cromafín y una célula pancreática β.
8. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la célula es una célula cromafín y el estímulo despolarizante es acetilcolina o al menos un agonista nicotínico.
9. Un método según las reivindicaciones 2 a 8 en el que la etapa inicial de determinación de la Cm en respuesta al estímulo se lleva a cabo en presencia de al menos un antagonista del receptor.
10. Un método según la reivindicación 9 en el que la célula secretora es una célula cromafín, el ligando es un agonista de un receptor acoplado a un canal iónico y el antagonista es un antagonista nicotínico.
11. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en el que la medida se lleva a cabo en presencia de un potenciador/activador de los receptores.
12. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en el que la célula posee al menos un canal de calcio dependiente de voltaje.
13. Un método según las reivindicación 12 en el que el canal de calcio dependiente de voltaje se selecciona del grupo de un canal tipo L, un canal tipo N, un canal tipo P/Q, un canal tipo T y un canal tipo R.
14. Un método según la reivindicación 12 ó 13 en el que la célula se ha tratado previamente con al menos un compuesto que causa la eliminación de las reservas intracelulares de calcio.
15. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14 en el que la medida se lleva a cabo en presencia de un potenciador/activador de los canales de calcio.
16. Un método para la identificación de inhibidores o activadores de la secreción en respuesta a un estímulo despolarizante que comprende las etapas de
en donde un valor de la diferencia entre C2 y C1 menor que el valor de dicha diferencia obtenido en ausencia de dicho compuesto indica que el compuesto es inhibidor de la secreción en respuesta al estímulo despolarizante y donde un valor de la diferencia entre C2 y C1 mayor que el obtenido en ausencia de dicho compuesto indica que el compuesto es activador de la secreción en respuesta al estímulo despolarizante.
17. Un método según cualquiera de las reivindicación 16 en el que la transición entre las etapas a y b y/o entre las etapas b y c se realiza en el orden de milisegundos.
18. Un método para la identificación de inhibidores o activadores de la secreción en respuesta a la despolarización de la membrana por un estímulo despolarizante que comprende las etapas de
en donde un valor de (C4-C3)-(C2-C1) menor que el obtenido en ausencia de dicho compuesto indica que el compuesto es inhibidor de la secreción en respuesta a la despolarización de la membrana y donde valor de (C4-C3)-(C2-C1) mayor que el obtenido en ausencia de dicho compuesto indica que el compuesto es activador de la secreción en respuesta a la despolarización de la membrana.
19. Un método para la identificación de inhibidores o activadores de un canal de calcio dependiente de voltaje en una célula que contiene dicho canal de calcio dependiente de voltaje y al menos un receptor acoplado a un canal catiónico que comprende
en donde un valor de la diferencia (C4-C3)-(C2-C1) menor que el aumento observado en ausencia del compuesto indica que el compuesto inhibe el canal de calcio dependiente de voltaje y donde un valor de la diferencia (C4-C3)-(C2-C1) mayor que el valor observado en ausencia del compuesto indica que el compuesto activa el canal de calcio dependiente de voltaje.
20. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 18 ó 19 en el que la transición entre las etapas d y e y/o entre las etapas e y f se realiza en el orden de milisegundos.
21. Un método según las reivindicaciones 16 a 20 en el que la célula es una célula cromafin.
22. Un método según la reivindicación 21 en el que el estímulo despolarizante es un agonista de un receptor de neurotransmisores acoplado a un canal iónico, preferiblemente acetilcolina o un agonista colinérgico.
23. Un programa de ordenador que incluye medios codificados para llevar a cabo los pasos del método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22.
24. Un medio legible por ordenador en el cual se almacenan medios codificados adaptados para llevar a cabo los pasos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23.
25. Un sistema automatizado de microelectrodos para realizar estudios de patch-clamp que contiene el programa definido en la reivindicación 23 o el medio legible definido en la reivindicación 24.
26. Un sistema según la reivindicación 25 que es un amplificador patch-clamp.
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