Método para la identificación de signos de disfunción neuronal pre-neurodegenerativos.

La presente invención está dirigida a la detección temprana de procesos degenerativos relacionados con desordenes neurodegenerativos. En concreto, hace referencia a un método para la identificación de signos de disfunción neuronal pre-neurodegenerativos en muestras biológicas mediante la detección de indicadores específicos y un kit para la realización del mencionado método

Método para la identificación de signos de disfunción neuronal pre-neurodegenerativos.

La presente invención está dirigida a la detección temprana de procesos degenerativos relacionados con desórdenes neurodegenerativos. En concreto, hace referencia a un método para la identificación de signos de disfunción neuronal pre-neurodegenerativos en muestras biológicas mediante la detección de indicadores específicos y un kit para la realización del mencionado método.

Antecedentes de la invención

Muchas enfermedades neurodegenerativas conllevan la pérdida de tipos específicos de neuronas. La enfermedad de Alzheimer, la de Parkinson, la esclerosis lateral amiotrófica, la retinitis pigmentosa, la atrofia muscular espinal y algunas degeneraciones cerebelosas son sólo unos ejemplos, y todos ellos suponen unos costes, personales, socioeconómicos y en sanidad, enormes. Poseen un claro componente genético, que incluye la herencia familiar o la existencia de factores de predisposición. La etiología de estas patologías, cuando se conoce, frecuentemente incluye mutaciones genéticas que acaban causando la activación de mecanismos apoptóticos que dan lugar a los síntomas clínicos (Thompson, 1995). Con el fin de impedir, retrasar el comienzo o reducir el progreso de estas patologías, se necesita entender los mecanismos involucrados en la muerte celular y conocer los eventos y estadios que se producen antes de que tenga lugar la verdadera degeneración neuronal. De esta manera, la identificación de fenómenos pre-neurodegenerativos permitirá detectar los primeros síntomas celulares de las enfermedades neurodegenerativas. Así, se podrán aplicar distintas terapias a pacientes o modelos experimentales durante los primeros estadios de la enfermedad, cuando aún no se manifiestan signos evidentes de la misma. El análisis de los signos de neurodegeneración tales como la aparición de marcadores de apoptosis, detecta las últimas fases de los procesos de degeneración, momento en el que ya no son efectivas la mayoría de las terapias. En la actualidad, no existe un protocolo para la identificación de los estadios tempranos de neurodegeneración ni de signos de pre-neurodegeneración.

Para llevar a cabo la presente invención se ha utilizado el ratón mutante pcd (Purkinje cell degeneration) el cual sufre la degeneración selectiva de ciertas poblaciones neuronales específicas. La mutación pcd es una mutación autosómica, recesiva y de penetración completa que se localiza en el cromosoma 13 (Mullen et al., 1976; Campbell y Hess, 1996). En esta mutación, sólo se ve afectado el gen nna1, ya que el ARNm de nna1 está reducido o alterado estructuralmente y los ARNm de los dos genes que flanquean a nna1 están inalterados (Fernández-González et al., 2002), nna1 codifica una proteína nuclear involucrada en procesos nucleares y asociada a la diferenciación y regeneración neuronal (Harris et al., 2000). Los animales pcd son modelos muy interesantes para el estudio de la degeneración neuronal ya que son considerados totalmente normales en el momento del nacimiento, previniendo la existencia de mecanismos prenatales compensatorios, y la neurodegeneración ocurre in periodos concretos, permitiendo una caracterización detallada y exacta del proceso de degeneración. En el ratón pcd, degeneran poblaciones neuronales específicas, entre las que se incluyen las neuronas de Purkinje del cerebelo (Mullen et al., 1976), los fotorreceptores de la retina (Lavail et al., 1982; Blanks et al., 1982) y las células mitrales del bulbo olfatorio (BO; Greer y Shepherd, 1982).

Además, en el ratón mutante pcd la población de células mitrales es una buena candidata para el estudio de la degeneración neuronal. Primero, la degeneración de estas células tiene lugar desde el día 60 al 90 de vida postnatal. (Greer y Shepherd, 1982). Sin embargo, la degeneración de las células de Purkinje comienza muy tempranamente, durante el desarrollo postnatal, cuando aún está teniendo lugar la maduración normal de las células (Mullen et al., 1976). Por el contrario, la degeneración de los fotorreceptores se prolonga mucho, mezclándose con fenómenos relacionados con el envejecimiento (Lavail et al., 1982; Blanks et al., 1982). Segundo, se conoce perfectamente la tipología neuronal del BO, sus conexiones y neuroquímica (Shipley et al., 1996; Kratskin y Belluzzi, 2003), la mutación no afecta directamente a otros tipos neuronales (Greer y Shepherd, 1982) y las células mitrales son fácilmente distinguibles de otras poblaciones neuronales bulbares por su tamaño y posición (Shipley et al., 1996; Kratskin y Belluzzi, 2003). Tercero, son las principales neuronas de proyección del BO, con actividades eléctricas y sintéticas elevadas y estables y por lo tanto sin periodos de inactividad (Friedman y Strowbridge, 2000; Lowe, 2003; Djurisic et al., 2004). Cuarto, a pesar de que el BO es la principal diana de la neurogénesis adulta, las células recién generadas se diferencian a diversos tipos de interneuronas (Altman, 1969; Lois y Álvarez-Buylla, 1994; Carleton et al., 2003), pero nunca a células mitrales. Constituyen, por lo tanto, una población celular homogénea, de edad similar y generada durante un momento concreto del desarrollo prenatal (Chuah et al., 2003).

Descripción de la invención

Descripción de las figuras

Figura 1

Pérdida progresiva de células mitrales en el ratón pcd

A-D. Imágenes de microscopía confocal de la capa de las células mitrales marcada con yoduro de propidio (PI) de un ratón control P70 (A), y ratones pcd P50 (B), P70 (C) y P90 (D). Cabe destacar la pérdida severa de células mitrales en los ratones pcd de P70 y P90. La única célula mitral (flecha) que se aprecia en D, exhibe un mareaje débil de la sustancia citoplásmica de Nissl teñida con PI. A-D: barra de escala de 25 μm. E. Análisis semicuantitativos de la densidad relativa de células mitrales de animales control y pcd de P50 a P90. La densidad de células mitrales se estimó midiendo el número de células mitrales por mm de longitud de la capa de las células mitrales en imágenes de microscopía confocal de secciones coronales similares. Las densidades absolutas de los ratones pcd se corrigieron en base a la relación existente entre los volúmenes del BO de cada grupo (volumen pcd/volumen control) para poder obtener datos comparables. F. Imágenes de microscopía confocal de disociados neuronales de células mitrales marcadas con PI. Se ha de destacar la presencia de nucleolos prominentes y gran cantidad de sustancia de Nissl en las células mitrales. Barra de escala: 10 μm.

Figura 2

Focos nucleares de daño y reparación de ADN en las células mitrales pcd

Imágenes de microscopía confocal de disociados neuronales de células mitrales de ratones P70 control y pcd. A-F. Doble inmunomarcaje para H2AX y ácidos nucleicos con PI. A, las células mitrales de ratones control no expresan γ-H2AX (B) mientras que las células mitrales pcd muestran un gran número de focos positivos a γ-H2AX (E y F) distribuidos por todo el núcleo, excluyendo el nucleolo, que aparece teñido con PI en C. Tras la tinción con PI (A y D las células mitrales muestran un mareaje citoplásmico similar del ARNr (sustancia de Nissl) en animales control (A) y mutantes (D). G-L. Doble inmunofluorescencia para la detección de H2AX y pATM en células mitrales control (G-I) y pcd (J-L). Se ha de destacar que pATM y H2AX colocalizan formando focos nucleares en las células mitrales pcd. Doble inmunomarcaje para H2AX y 53BP1 en células mitrales control (M-P) y pcd (Q-R). 53BP1 se redistribuye pasando de tener un patrón nuclear difuso en las neuronas control (M) a formar focos nucleares en las neuronas pcd, donde colocaliza con H2AX (Q-S). Barra de escala: 5 μm.

Figura 3

Inhibición transcripcional en las células mitrales pcd

Imágenes de microscopía confocal de disociados neuronales de células mitrales de ratones control (A, C y E) y pcd (B, D y F). La inmunodetección de la histona acetilada H4 y de la ARN polimerasa II (H5) presentan un patrón punteado similar para ambos marcadores en las células mitrales control (A-C) con focos nucleares intensamente teñidos, mientras que se detecta una señal nuclear débil para estas dos moléculas dependientes de transcripción en las células mitrales pcd (B y D). E...

1. Método para la identificación de signos pre-neurodegenerativos de disfunción neuronal en muestras biológicas aisladas que comprende el análisis de los patrones de expresión de los siguientes indicadores:

a) Detección de la histona γ-H2AX, y

b) detección de la reducción de la histona H4 acetilada, en comparación con las células control.

2. Método según la reivindicación 1, donde además se identifica pATM ó 53BP1.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde además se detecta la reducción de ARN polimerasa II fosforilada en la Serina 2, en comparación con las células control.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde además se detecta el aumento de expresión de la histona H4 trimetilada, en comparación con las células control.

5. Métodos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde además se detecta la relocalización de coilina en forma de caperuzas perinucleolares.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la detección de los indicadores se hace usando anticuerpos o sus fragmentos.

7. Método según la reivindicación 6, donde la histona γ-H2AX se detecta con el anticuerpo anti-γ-H2AX de ratón y la histona H4 acetilada se detecta con el anticuerpo anti-H4 acetilada de conejo.

8. Método según la reivindicación 7, donde la histona H4 trimetilada se detecta con el anticuerpo anti-H4-K20-3Me de conejo.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los signos pre-neurodegenerativos de disfunción neuronal se correlacionan con cualquiera de las siguientes enfermedades del grupo compuesto por la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington, la esclerosis lateral amiotrófica, degeneraciones cerebelares, la esclerosis múltiple y encefalopatías espongiformes transmisibles (TSE).

10. Método según la reivindicación 9, en el que las TSE identificadas se encuentran en el grupo que comprende al Scrapie, la encefalopatía espongiforme bovina, la enfermedad del desgaste crónico, la enfermedad de Creutzfeld-Jakob (CJD), la nueva variante de CJD, la CJD esporádica, el síndrome de Gerstmann-Straussler Sheinker, el Kuru y el insomnio familiar fatal.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde las muestras biológicas aisladas comprenden muestras de tejido celular.

12. Método según la reivindicación 11, donde las muestras biológicas aisladas de tejido celular comprenden la totalidad o fracciones del sistema nervioso central y periférico, incluyendo el cerebro, la médula espinal, la retina, los ganglios, nervios y órganos sensoriales.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde las muestras biológicas aisladas proceden de mamíferos.

14. Método según la reivindicación 13, donde los mamíferos son humanos.

15. Kit que comprende los anticuerpos anti-γ-H2AX de ratón y anti-H4 acetilada de conejo para la detección de los patrones de expresión de los indicadores histona γ-H2AX e histona H4 acetilada.

16. Kit según la reivindicación 15, donde además comprende el anticuerpo anti- H4-K20-3Me de conejo para la detección del patrón de expresión histona H4 trimetilada.

17. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 15 ó 16, donde además comprende anticuerpos secundarios marcados capaces de unirse a cualquiera de dichos anticuerpos primarios.

18. Uso del kit según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17 para identificar signos pre-neurodegenerativos de disfunción neuronal en muestras biológicas aisladas.