La presente invención pertenece al campo técnico de la biotecnología vegetal y en particular se refiere a un método novedoso para obtener muchos análogos,

derivados, metabolitos precursores diferentes de compuestos valiosos en una ruta biosintética a partir de una población novedosa de plantas generada a través de un método de transformación genética. Dicha población expresa y acumula perfiles únicos de compuestos valiosos en una ruta

Método para crear una población combinatoria de plantas transgénicas que expresan y acumulan una diversidad de metabolitos valiosos.

Campo técnico

La presente invención pertenece al campo técnico de la biotecnología vegetal y en particular se refiere a un método novedoso para obtener muchos análogos, derivados, metabolitos precursores diferentes de compuestos valiosos en una ruta biosintética a partir de una población novedosa de plantas generada a través de un método de transformación genética. Dicha población expresa y acumula perfiles únicos de compuestos valiosos en una ruta.

Técnica anterior

Desde la creación de las primeras plantas transgénicas en los primeros años 80 que expresaban transgenes individuales junto con un gen marcador seleccionable/detectable, se ha atestiguado una plétora de ejemplos en muchas especies de plantas diferentes, mediante los cuales se introdujeron uno o relativamente pocos transgenes o bien de manera secuencial o bien concomitante en plantas. La mayoría de las plantas transgénicas resultantes expresaban rasgos genéticos individuales, por ejemplo resistencia a insectos o tolerancia a herbicidas, tolerancia a diversos estreses, rasgos relacionados con el desarrollo y la morfología de la planta, manipulación del almacenamiento de semillas y otras proteínas y similares. En el contexto de la creación de plantas que contienen lo que se denomina comúnmente "rasgos de producción o de valor añadido", existe un grave obstáculo que es necesario superar, es decir, formas generales y eficaces de introducir en las plantas múltiples transgenes que necesitan expresarse secuencial y coordinadamente de manera que imite/potencie rutas de múltiples etapas endógenas o reconstituya rutas exógenas.

La manipulación de rasgos complejos esta comenzando ahora a tener lugar y algunos ejemplos iniciales incluyen la creación de plantas transgénicas que expresan anticuerpos secretores (Ma et al., 2003, Nicholson et al., 2005), producción de productos químicos industriales tales como bioplásticos (Van Beilen y Poirer 2007, Moire et al., 2003, Poirer et al., 1992), modificación de almidón (Firouzabadi et al., 2007), ácidos grasos (Truska et al., 2006, Qi et al., 2004, Abdadi et al., 2004, Wu et al., 2005) y coloración de flores (Tanaka et al., 2005), modificación por ingeniería de especies leñosas con composición alterada de lignina (Halpin 2004, Hopkins et al., 2007, Campbell et al., 2003), plantas para bioenergía (Sticklen et al., 2006, Biswass et al., 2006), la creación de germoplasma con niveles alterados de poliaminas y aminoácidos (Altenbach et al., 1992, Galili y Hofgen 2002) y vitaminas (Ye et al., 2000, Ducreaux et al, 2005, Diretto et al., 2005, Shintani y Della-Penna, 1998, Van Eenennaam et al., 2003). Ahora es evidente a partir de estos y otros ejemplos que la etapa de transferencia génica, es decir, la introducción de varios transgenes en una planta puede ser posible y quizá en alguna ocasión de rutina. Sin embargo, esto está limitado en la mayoría de los casos a dos o tres y en raras ocasiones a unos cuantos transgenes más. Varios informes describen incluso la introducción de múltiples transgenes en células de semilla de soja (12 plásmidos, Hadi et al., 1996) y plantas de arroz (14 transgenes, Chen et al; 9 transgenes, Wu et al., 2002). Sin embargo, en estos ejemplos los transgenes eran independientes entre sí, es decir, no eran parte de una ruta metabólica/biosintética. Además, no está claro a partir de estos ejemplos cómo se expresan realmente muchos de los transgenes transferidos y a qué niveles. En consecuencia, estos ejemplos sólo demuestran que es posible introducir múltiples genes en plantas pero no se proporciona información sobre la expresión o segregación no deseable en generaciones posteriores, de manera crucial para transgenes que necesitan expresarse coordinadamente como componentes de una ruta metabólica/biosintética. Varios informes posteriores cuestionan la utilidad de tales enfoques precisamente debido a las dos limitaciones de falta de expresión y segregación a través de la progenie (véase a continuación).

"Halpin C. 2005. Gene stacking in transgenic plants-the challenge for 21^st century plant biotechnology. Plant Biotech J. 3: 141-155". En este artículo, el autor identifica la modificación por ingeniería de múltiples genes, especialmente aplicada a rutas metabólicas, como la restricción principal de la biotecnología vegetal contemporánea que detiene la modificación por ingeniería de plantas para rasgos complejos y multigénicos.

"Ralley et al., 2004 Metabolic engineering of ketocarotenoid formation in higher plants The Plant J. 39:477-486". Las estrategias usadas en este artículo para introducir rutas de múltiples etapas en plantas superiores han estado precedidas clásicamente por la realización de experimentos de transformación individuales, caracterizando luego la progenie y cruzando posteriormente líneas adecuadas (Ma et al., 1995). También se han usado enfoques de transformación conjunta o nueva transformación pero es improbable que logren la expresión coordinada. Como alternativa, este artículo describe el uso de transgenes ligados que producen una poliproteína que se escinde mediante una secuencia autoescindible corta. Esto se pone como ejemplo para 2 genes sólo (véase la página 483, discusión, columna izquierda).

"Halpin et al., 1999 Self-processing 2A-polyproteins-a system for co-ordinate expression of múltiple proteins in transgenic plants. The Plant J 17:453-459" "Achieving co-ordinate, high level and stable expression of múltiple transgenes in plants is currently difficult". Este artículo sólo demuestra el concepto con 2 genes, no más, tal como se demuestra en la presente invención.

"Kourtz et al., 2005 A novel thiolase-reductase gene fusión promotes the production of polyhydroxybutyrate in Arabidopsis. Plant Biotechnol J 3:435-447". Este artículo muestra claramente los tipos de experimentos difíciles que será necesario realizar para lograr la modificación compleja por ingeniería de rasgos múltiples y, en esencia, esto apoya la novedad de la presente invención.

"Daniell and Dhingra 2002 Multigene engineering: dawn of an exciting new era in biotechnology. Current Opinión in Biotechnology 13:136-141". Este es otro artículo que apoya la novedad de la presente invención por varias razones. En primer lugar, identifica problemas que ha resuelto el método de la presente invención (véase la primera página de la introducción en este artículo). De manera igualmente importante, sugiere que la modificación por ingeniería de plastos resolverá todos los problemas de la modificación por ingeniería metabólica, pero a pesar del hecho de que este artículo se redactó en 2002, no se han publicado artículos desde esa fecha que den ejemplos específicos y demuestren las ventajas de la modificación por ingeniería de plastos, particularmente para la modificación por ingeniería de rutas metabólicas que requieren la inserción de múltiples genes y su expresión coordinada. Todavía queda por demostrar para múltiples genes (más de 2-3).

"Halpin and Boerjan 2003 Stacking transgenes in forest trees. Trends in plant Science 8:363" Este documento establece los problemas con la modificación por ingeniería de múltiples genes y esto apoya de nuevo la novedad de la presente invención.

"Wurtzel 2004 Genomics, Genetics and biochemistry of maize carotenoid biosynthesis in ``Secondary metabolism in Model systems'' Recent Advances in Phytochemistry Vol 38: 85-110, JT Romeo Edt, Elsevier 2004". En las páginas 102-103, el autor reivindica que: ". . . en el maíz, la manipulación de carotenoides sólo será posible si se elimina una serie de restricciones. Específicamente, entender completamente cómo está regulada la ruta en cuanto a la expresión génica, ubicación de actividades enzimáticas y flujo de sustratos. El autor establece además que la tecnología está limitada por las deficiencias actuales en el entendimiento de la expresión de genes endógenos. Se sabe poco sobre las interacciones entre rutas endógenas e introducidas y su competencia por los sustratos. El descubrimiento de que muchas de las enzimas del maíz están codificadas por pequeñas familias de genes hace las cosas incluso más complicadas (véase el texto). La compartimentalización en diferentes orgánulos subcelulares también se presenta como un problema". La metodología...

1. Procedimiento de obtención de plantas transgénicas, caracterizado porque dichas plantas se obtienen por transformación genética conjunta en una planta de un número ilimitado de genes que participan en una ruta metabólica.

2. Procedimiento de obtención de plantas transgénicas según la reivindicación 1, en el que la ruta metabólica se selecciona de la ruta de los carotenoides, la vitamina C y/o la vitamina E.

3. Procedimiento de obtención de plantas transgénicas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las plantas transgénicas sobreexpresan o subexpresan los productos codificados por dichos genes en comparación con las plantas de tipo natural.

4. Procedimiento de obtención de plantas transgénicas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la planta transgénica es maíz.

5. Procedimiento de obtención de plantas transgénicas según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la planta transgénica es arroz.

6. Procedimiento de obtención de plantas transgénicas según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la planta transgénica es tabaco.

7. Planta transgénica obtenida por medio de un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

8. Uso de una planta transgénica según la reivindicación 7, para la producción de metabolitos derivados de una ruta metabólica.

9. Uso según la reivindicación 8, en el que la ruta metabólica se selecciona de la ruta de los carotenoides, la vitamina C, el folato y/o la vitamina E.