MÉTODO DE SÍNTESIS PEPTÍDICA EN FASE SÓLIDA.

Conjugado de peptido-resina A-W, en el que A es P-X1-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-X2- en donde P es hidrogeno o un grupo protector seleccionado del grupo que consiste en Boc,

Fmoc, Dde, Nps, Alloc y Z; X1 es un resto peptidilo de 0 a 200 aminoacidos, que comprende opcionalmente grupos protectores sobre cadenas laterales de aminoacidos individuales; R4, R5, R6, R7, R8 y R9 son grupos protectores de cadenas laterales de aminoacidos; X2 es un solo residuo de aminoacido que esta conectado al material compuesto en fase solida de formula (II) a traves de -O- y que opcionalmente esta protegido en la cadena lateral; y W es un material compuesto en fase solida de formula **Fórmula** en el que R1" es hidrogeno, 4-(alquilo C1-C4) o 4-(alcoxi C1-C4), R2" es cloro, hidrogeno, 4-(alquilo C1-C4) o 4-(alcoxi C1-C4), siendo R1" y R2" iguales o diferentes, con la condicion de que solo uno de R1", R2" pueda ser hidrogeno, y con la condicion de que R1" sea hidrogeno si R2" es 2-cloro; y R"' es una fase solida

La presente invención se refiere a un método mejorado de síntesis peptídica en fase sólida del péptido anticoagulante bivalirudina, el llamado 'hirulog'. Se refiere además a los respectivos productos conjugados de péptido-fase sólida que comprenden el péptido todavía protegido unido a la resina.

Los inhibidores de trombina se consideran antitrombóticos prometedores. El procesamiento proteolítico mediante trombina es fundamental en el control de la coagulación sanguínea. La hirudina, un potente inhibidor clínico de trombina procedentes de la sanguijuela chupadora se sangre Hirudo medicinalis, consiste en 65 aminoácidos. Análogos peptídicos más cortos del segmento peptídico 45-65 de hirudina, los llamados hirulogs, han resultado ser eficaces en el tratamiento de la trombosis, una afección que pone en peligro la vida.

Okayama et ál. (1996, Chem. Pharm. Bull. 44:1344-1350) y Steinmetzer et ál. (1999, Eur. J. Biochem. 265: 598-605) idean la síntesis en fase sólida de diferentes hirulogs sobre resina de Wang, esto es, usando el enlace éster del Fmoc-aminoácido C-terminal a una resina que está esterificada a un radical alcohol pbenciloxibencílico. La resina de Wang requiere la escisión del péptido desde la resina con ácido trifluoroacético concentrado, para lo cual la escisión desde la resina acarrea la desprotección global concomitante del péptido.

La escisión acidolítica desde la resina de Wang se aplica bajo condiciones fuertemente ácidas y se sabe que inevitablemente incurre en la alquilación no deseable de residuos de Trp como una reacción secundaria, a pesar del uso de reactivos eliminadores durante la acidólisis (Giraud et ál., 1999, J. Peptide Science 5:457-461). En particular, el Trp C-terminal es propenso a tal reacción secundaria (Atherton et ál., 1988, Tetrahedron 44:843-857). La alquilación está provocada por iones carbenio aromáticos generados a partir del resto fenoxi conector de la resina de Wang. Aunque los hirulogs no contienen residuos de Trp, sí comprenden en la posición Cproximal un residuo de Tyr. Se encuentra y presenta en la presente por primera vez que este residuo de Tyr es igualmente propenso a la alquilación errática durante la escisión de la resina de Wang, afectando negativamente a la pureza del producto.

Freund y Robinson divulgan el uso de la 2-clorotritil-resina para la elongación de la cadena siguiendo en protocolo de Alloc cuando se sintetiza el heptapéptido H-D-Leu-D-Try-L-Asn-Hpg-L-Tyr--Dhpg-OH (1999, Chem. Commun., 2509-2510). La divulgación no dice nada acerca de la alquilación errática de uno cualquiera de los residuos de aminoácido, y no se sugiere que el uso de la 2-clorotritil-resina tenga un efecto positivo para suprimir esta reacción secundaria.

El objetivo de la presente invención es idear un método mejorado para sintetizar los péptidos de hirulog respectivos que carezca de las desventajas de la técnica anterior.

10 Este objetivo se resuelve mediante los conjugados de péptido-resina y el método de síntesis respectivo ideado por la presente invención.

De acuerdo con la presente invención, se idea un método para liberar y desproteger un conjugado de péptido-fase sólida para dar finalmente un péptido, preferiblemente un péptido de la fórmula -D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-GlyAsp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH. Dicho conjugado de péptido-fase sólida comprende un asa de 2-clorotritilo de fórmula

**(Ver fórmula)**

en la que A = Boc-D-Phe-Pro-Arg(R2)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-O-o A = Fmoc-D-PhePro-Arg(R2)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Olu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-O-o A = NH2-D-Phe-Pro-Arg(R2)-Pro-Gly-GlyGly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)Tyr(R9)-Leu-O-y en la que R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 son grupos protectores de cadenas laterales de aminoácidos y en la que R1 es una fase sólida insoluble. La secuencia peptídica anterior es la de hirulog-8 (descrita en EP-489 070). Es un derivado bivalente 20mero de hirudina (un 65mero), un potente inhibidor de trombina presente en la naturaleza. Está constituido por motivos estructurales conectados, funcionalmente importantes, procedentes de hirudina: El motivo de unión al sitio activo D-Phe-Pro-Arg-Pro y la secuencia carboxiterminal Asn9 a Leu20 procedente de hirudina, puenteados por un espaciador de tetraglicina. En la presente memoria, “-D-Phe-” significa D-fenilalanina, en oposición al enantiómero L presente en la naturaleza.

Opcionalmente, en un objetivo adicional de la presente invención, el radical A en la fórmula I puede ser cualquiera de los siguientes:

1. A es P-X1-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)Tyr(R9)-X2, en donde X1 es un resto peptidilo, que comprende opcionalmente grupos protectores sobre cadenas laterales de aminoácidos individuales, de 0 a 200, preferiblemente de 1 a 100, lo más preferiblemente de 2 a 50 aminoácidos, y en donde X2 es una sola cadena opcionalmente lateral o un residuo de aminoácido protegido C-terminalmente conectado a la fase sólida a través de -O-, en donde preferiblemente X2 no es Trp, Cys o Arg, y en donde P es H (es decir, da -NH2) o un grupo protector, preferiblemente el grupo protector es un grupo protector ortogonal o es uno retirable bajo condiciones fuertemente ácidas según se define posteriormente, más preferiblemente el grupo protector se selecciona del grupo que consiste en Boc, Fmoc, Dde, Nps, Alloc y Z. La conexión -O-puede ser bien un enlace éster o éter unido al asa

o el conector a través de una cadena lateral o bien un grupo carboxi Cα o una función hidroxi de la cadena lateral.

2. A es P-X1-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)Tyr(R9)-Leu-O Las definiciones para P, X1, X2 se aplican coherentemente a todas estas posi

bles realizaciones para A y los conjugados de péptido-fase sólida resultantes.

Se encuentra y presenta en la presente memoria por primera vez que dicho residuo de Tyr es igualmente propenso a la alquilación errática durante la escisión desde resina de Wang, afectando negativamente a la pureza del producto. En el caso del hirulog, tal modificación parece estar promovida por un efecto de proximidad similar al observado para Trp por Atherton et ál. Sin embargo, la alquilación de Tyr,

p. ej. en el caso de la desprotección de Arginina, nunca se ha presentado como un problema general, bastante en contraste con el Trp (Atherton et ál., 1989, Solid phase synthesis: A practical approach, IRL press, Oxford). Además, las observaciones de Atherton trataban el Trp C-terminal solamente, mientras que el residuo de Tyr en el péptido de hirulog, sintetizado en la dirección C a N-terminal, es solamente el yuxtaproximal, esto es, el segundo residuo próximo al extremo C de la cadena peptídica en crecimiento. En retrospectiva, sin querer limitarse por una teoría, esto puede explicarse por que los restos fenoxi son más reactivos que los compuestos arílicos promedio en la sustitución electrófila. En efecto, los fenoles se usan como agentes elimina-dores en la escisión acidolítica de la resina (D. S. King et ál., 1990, Int. J. Peptid Protein Res., 36, 255). Dicha reacción secundaria todavía no se ha descrito o sugerido. Hasta ahora se ha creído que solo el Trp terminal era vulnerable a este respecto. Por consiguiente, la resina de Wang se ha empleado ampliamente en la técnica anterior, hasta hace poco, para la síntesis de hirulog.

El conjugado de péptido-fase sólida de la presente invención puede sintetizar-se mediante métodos en fase sólida habituales bien conocidos en la técnica, y bien descritos y mencionados en Bodanszky et ál., Principles of Peptide Synthesis, 2ª ed., Springer Verlag Berlin Heidelberg 1989. Necesariamente, debido a la labilidad frente a los ácidos de la ligazón en fase sólida, tal estrategia sintética emplea la química del Fmoc para llevar a cabo las reacciones de acoplamiento durante la síntesis en fase sólida. Sólo el último residuo de D-Phe de terminación puede estar protegido bien por Boc o bien por Fmoc. Tal protección con Fmoc pede eliminarse todavía sobre la resina, mediante tratamiento estándar con, p. ej., piperidina al 20% u otro reactivo básico desprotector de Fmoc para dar el conjugado de péptido-resina de la presente invención, pero con un grupo amino N-terminal libre. Sin embargo, tal desprotección temprana de Fmoc, que expone tempranamente el extremo N, hace a dicho residuo de D-Phe N-terminal...

1. Conjugado de péptido-resina A-W, en el que A es P-X1-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)-Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-X2en donde P es hidrógeno o un grupo protector seleccionado del grupo que consiste en Boc, Fmoc, Dde, Nps, Alloc y Z; X1 es un resto peptidilo de 0 a 200 aminoácidos, que comprende opcional-mente grupos protectores sobre cadenas laterales de aminoácidos individuales; R4, R5, R6, R7, R8 y R9 son grupos protectores de cadenas laterales de aminoácidos; X2 es un solo residuo de aminoácido que está conectado al material compuesto en fase sólida de fórmula (II) a través de -O-y que opcionalmente está protegido en la cadena lateral; y

15 W es un material compuesto en fase sólida de fórmula

**(Ver fórmula)**

en el que R1” es hidrógeno, 4-(alquilo C1-C4) o 4-(alcoxi C1-C4), R2” es cloro, hidrógeno, 4-(alquilo C1-C4) o 4-(alcoxi C1-C4), siendo R1” y R2” iguales o diferentes, con la condición de que solo uno de R1”, R2” pueda ser hidrógeno, y con la condición de que R1” sea hidrógeno si R2” es 2-cloro; y R”' es una fase sólida.

2. Conjugado de péptido-resina de acuerdo con la reivindicación 1, caracteri25 zado porque R1” es hidrógeno y R2” es 2-cloro, 4-metoxi o 4-metilo.

3. Conjugado de péptido-resina de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque tanto R1” como R2” son 4-metoxi.

4. Conjugado de péptido-resina de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la fase sólida R”' es una resina polímera.

5. Conjugado de péptido-resina de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque X2 es Leu.

6. Conjugado de péptido-resina de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque X2 no es Tip, Cys o Arg.

7. Conjugado de péptido-resina de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque X1 comprende de 0 a 50 residuos de aminoácido.

8. Conjugado de péptido-resina de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque R9 es terc-butilo.

9. Conjugado de péptido-resina de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en el que A se selecciona de Boc-D-Phe-Pro-Arg(R2)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-O-, Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(R2)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-O-y H-D-Phe-Pro-Arg(R2)-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn(R3)-Gly-Asp(R4)-Phe-Glu(R5)Glu(R6)-Ile-Pro-Glu(R7)-Glu(R8)-Tyr(R9)-Leu-O-, y en el que R2 y R3 son grupos protectores de cadenas laterales de aminoácidos y la fase sólida es insoluble.

10. Conjugado de péptido-resina de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la fase sólida es polímera y tiene un tamaño de malla de malla 100 a 400 (US Bureau of Standards).

11. Conjugado de péptido-resina de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque R2 es pentametildihidrobenzofurano, adamantiloxicarbonilo o isoborniloxicarbonilo; R9 es terc-butilo; y R3 a R8 son grupos protectores lábiles frente a ácidos.

12. Conjugado de péptido-resina de acuerdo con las reivindicaciones 9 u 11, caracterizado porque R2 es Pbf y R4 a R9 son grupos protectores lábiles frente a ácidos que requieren ácido trifluoroacético al menos al 50% para la retirada.

13. Conjugado de péptido-resina de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado porque R3 es tritilo; y R4, R5, R6, R7 y R8 son terc-butilo.

14. Conjugado de péptido-resina de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado porque R9 es terc-butilo.

15. Conjugado de péptido-resina de acuerdo con una de las reivindicaciones 9 u 11 a 14, caracterizado porque el resto -Arg(R2)-Pro- es -Arg[psiCH2NH]Pro-.