La invención se refiere a un método de diagnóstico y determinación de pronóstico de cánceres del tipo que expresa el receptor HER2 o sus variantes truncadas.

El método comprende la detección de la presencia en una muestra de una de las formas truncadas del citado receptor HER2. La invención también proporciona nuevos anticuerpos específicos de esta forma truncada, así como kits que los comprenden

Método de diagnóstico de cánceres que expresan el receptor HER2 o sus variantes truncadas.

La presente invención se refiere a un método de diagnóstico y determinación de pronóstico en muestras aisladas de cánceres en los que se expresa el receptor HER2. La invención también propone compuestos de aplicación en el diagnóstico e identificación precoz del cáncer.

Estado de la técnica

HER2 (también conocido como c-erbB2, ErbB2 o Neu) es una proteína transmembrana del tipo I que pertenece a la familia del receptor del factor de crecimiento epidérmico o EGFR (del inglés Epidermal Growth Factor Receptor), también conocido como HER1 o ErbB1. Dos miembros adicionales, HER3 y HER4 completan esta familia. Cuando HER1, 3 ó 4 se unen a un ligando tipo EGF, su dominio extracelular adopta la conformación denominada "abierta", la cual permite la formación de homodímeros o heterodímeros. Por el contrario, HER2 aunque no se una a ningún ligando, también interacciona con otros receptores HER unidos a ligando, debido a que su dominio extracelular está de manera constitutiva en conformación "abierta".

La dimerización dirigida por el dominio extracelular conduce a la interacción de las quinasas intracelulares de los receptores HER y a la subsiguiente transfosforilación de algunos residuos de tirosina. Estas fosfotirosinas, situadas en el extremo C-terminal de los receptores HER, actúan como acopladores de un grupo de proteínas intracelulares de unión a fosfotirosinas. Las interacciones establecidas en la membrana plasmática son transducidas al núcleo celular por medio de distintas vías de señalización, tales como la vía de la proteína quinasa activada por mitógeno activada por Ras (MAPK), la vía de la proteína quinasa activada por estrés, la fosfolipasa C gamma, etc. Todos estos circuitos de señalización controlan la expresión de genes que actúan de manera coordinada para modificar aspectos determinantes del estado celular, tales como la proliferación celular, la migración, la supervivencia y la adhesión. Así, dependiendo del contexto celular, la activación de los receptores HER resulta en una respuesta celular dramática que puede ir desde la transformación a célula maligna a una senescencia prematura.

Además del modo de señalización canónico, los receptores HER o fragmentos de los mismos pueden ser endocitados y transportados a núcleo, donde directamente pueden regular la expresión de ciertos genes. Este hecho se ha observado para el caso concreto de HER2 (Wang et al., "Binding at and transactivation of the COX-2 promoter by nuclear tyrosine kinase receptor ErbB-2", Cancer Cell-2004, Vol. 6, pp. 251-261), así como para un fragmento carboxiterminal (CTF, del inglés Carboxy Terminal Fragments), que consiste en una forma truncada del receptor HER4, que incluye el dominio citoplasmático entero (Linggi et al., "ErbB-4 s80 intracellular domain abrogates ETO2-dependent transcriptional repression", J. Biological Chemistry-2006, Vol. 281, pp. 25373-25380).

En tumores mamarios humanos se han encontrado frecuentemente una serie de fragmentos carboxiterminales o CTFs (del inglés Carboxy Terminal Fragments), que se asume que incluyen los dominios transmembrana y citoplasmático de HER2. (Molina et al, "NH(2)-terminal truncated HER2 protein but not full-length receptor is associated with nodal metastasis in human breast cancer", Clinical Cancer Research-2002, Vol. 8, pp. 347-353). Se conoce además que las pacientes con cáncer de mama que expresan los CTFs de HER2, o, lo que es lo mismo, formas truncadas que no incluyen el extremo N-terminal de HER2 (HER2 CTFs), tienen mayor probabilidad de desarrollar metástasis (Molina et al. 2002 - supra) y un pronóstico peor que aquellas pacientes que expresan predominantemente la forma completa de HER2 (Saez et al., "p95HER2 predicts worse outcome in patients with HER2-positive breast cancer", Clinical Cancer Research-2006, Vol. 12, pp. 424-431).

Por ello, resulta muy importante poder detectar a tiempo la presencia de HER2 en tumores y más aún poder determinar si está en forma completa o truncada (CTF).

Hoy en día, a nivel de clínica rutinaria se emplean anticuerpos para detectar la presencia de la forma completa de HER2, a fin de determinar ante qué tipo de tumor mamario nos encontramos. En el caso de detectarse la presencia de HER2, la terapia recomendada consiste en la administración de anticuerpos monoclonales terapéuticos, tal como el trastuzumab de Genentech. El uso de este anticuerpo monoclonal para el tratamiento del cáncer, aparece descrito en el documento de solicitud de patente WO 8906692 de Genentech. En WO 8906692 se describen anticuerpos monoclonales o policlonales dirigidos contra la región extracelular de HER2, coincidiendo esta región extracelular con el dominio externo completo de la proteína, que es su extremo N-terminal. Se relaciona una serie de anticuerpos monoclonales con líneas de cáncer de mama concretas. Según se ha indicado anteriormente, los epítopos reconocidos por los anticuerpos citados en WO 8906692 son regiones antigénicas del dominio extracelular de la forma completa de HER2 y no incluyen formas truncadas o fragmentos carboxiterminales de HER2. Por ello, con los anticuerpos y el método de diagnóstico descritos en WO 8906692 no se podrá detectar la presencia de HER2 truncados (CTFs). Además, en tumores mamarios donde dichos CTFs de HER2 se expresan, los anticuerpos como el trastuzumab no resultan terapéuticos, puesto que no reconocen a ningún epítopo. Este hecho explica la resistencia al tratamiento con trastuzumab que se observa en los pacientes que expresan formas truncadas (CTFs) de HER2.

Los pacientes que mayoritariamente expresan formas truncadas o CTFs de HER2 deberían ser tratados con terapias alternativas para evitar las cifras de pronóstico pobre observadas por Sáez et al 2006 (supra). En cualquier caso, con la finalidad de detectar (diagnosticar) y tratar cuanto antes a las personas que tengan tumores en los que se expresan formas truncadas de HER2, resulta muy interesante poder diferenciar qué tipo de forma de HER2 se expresa para luego actuar en consecuencia.

En el documento de Anido et al., "Biosíntesis of tumorigenic HER2 C-terminal fagments by alternative initiation of translation", European Molecula Biology Organization (EMBO) Journal-2006, Vol. 25, pp. 3234-3244, se describe que, además del fragmento generado por la acción de las alfa-secretasas sobre HER2, que da lugar a una forma truncada CTF conocida como P95, que incluye el fragmento transmembrana y citoplasmático del receptor, también se generan dos formas truncadas CTF, mediante un mecanismo de iniciación alternativa de la traducción a partir de dos metioninas situadas aguas arriba y aguas abajo, respectivamente, del dominio transmembrana de HER2. Concretamente, las metioninas para iniciación alternativa de la traducción corresponden a la metionina 611 y a la metionina 687 de la secuencia de aminoácidos con el número de acceso M11730.1 de la base de datos UniGene del National Center for Biotechnology Information (NCBI). Este documento también demuestra que estas formas alternativas del receptor HER2 (CTFs) están presentes en tumores mamarios. Concretamente, se indica que la más abundante corresponde a la forma denominada CTF687, o lo que es lo mismo, a la proteína obtenida por la iniciación alternativa de la traducción a partir de la metionina en posición 687. Anido et al. propone como terapia el uso de inhibidores de la actividad tirosinquinasa de HER2, tal como lapatinib, para minimizar el crecimiento de los tumores que expresan esta formas truncadas de HER2. Los inhibidores de la tirosinquinasa actúan interaccionando con el extremo C-terminal del receptor HER2 que está presente de forma íntegra tanto en el receptor completo como en los CTFs derivados del mismo o producidos por iniciación alternativa de la traducción.

El documento de Scaltriti et al, "Expresión of p95HER2, a truncated form of the HER2 Receptor, and response to anti-HER2 therapies in breast cancer", Journal of National Cancer Institute-2007, Vol. 99, pp. 628-368, representa un ejemplo de estudio de metodología alternativa para detectar la presencia de una de las formas truncadas del receptor HER2 y detalla algunas de las posibles causas de la resistencia al tratamiento con trastuzumab (Herceptin). Concretamente, se hace hincapié en la acumulación del fragmento p95HER2 (producto de proteólisis... [Seguir leyendo]

1. Método de diagnóstico y determinación de pronóstico en muestras aisladas de cánceres del tipo que expresa el receptor HER2 y/o sus variantes truncadas, que comprende la detección de la presencia en la muestra de la forma truncada del receptor HER2 que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la detección se lleva a cabo con medios seleccionados independientemente del grupo formado por: detección por migración diferencial de la forma truncada del receptor HER2 que consiste en la SEQ ID NO: 1, respecto de la forma completa del citado receptor HER2; y detección por unión con anticuerpos específicos de la forma truncada del receptor HER2 que consiste en la SEQ ID NO: 1.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que la detección se lleva a cabo con al menos un anticuerpo, específico de un epítopo definido por una secuencia incluida en la SEQ ID NO: 2.

4. Método según la reivindicación 3, que comprende la detección del epítopo definido por la SEQ ID NO: 3 con al menos un anticuerpo.

5. Péptido aislado que consiste en la SEQ ID NO: 3.

6. Anticuerpo o fragmento del mismo que reconoce un epítopo de una forma truncada del receptor HER2, dicho epítopo definido por una secuencia incluida en la SEQ ID NO: 2.

7. Anticuerpo o fragmento del mismo que reconoce un epítopo de una forma truncada del receptor HER2, dicho epítopo definido por la SEQ ID NO: 3.

8. Anticuerpo o fragmento del mismo según las reivindicaciones 6 ó 7, que es un anticuerpo policlonal.

9. Anticuerpo o fragmento del mismo según las reivindicaciones 6 ó 7, que es un anticuerpo monoclonal.

10. Anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 9, producido por la línea celular hibridoma depositada en el "Deutschland Sammlung von Mikroorganismen und Zellen - DSMZ" con número de acceso DSM ACC2904.

11. Fragmentos del anticuerpo de las reivindicación 6 ó 7 seleccionados del grupo formado por F(ab), F(ab') y Fv.

12. Línea celular hibridoma con número de acceso DSM ACC2904 depositada en el "Deutschland Sammlung von Mikroorganismen und Zellen - DSMZ".

13. Uso de un anticuerpo o fragmento del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, para el diagnóstico y determinación de pronóstico en muestras aisladas de cánceres en los que se expresa el receptor HER2.

14. Agente de diagnóstico y determinación de pronóstico en muestras aisladas de cánceres del tipo que expresa el receptor HER2 o sus variantes truncadas, que comprende al menos un anticuerpo o un fragmento del mismo según una de las reivindicaciones 6 a 11.

15. Agente diagnóstico según la reivindicación 14, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo está dispuesto en un soporte sólido.

16. Kit de diagnóstico y determinación de pronóstico en muestras aisladas de cánceres del tipo que expresa el receptor HER2 o sus variantes truncadas, que comprende medios de detección de la presencia en la muestra de la forma truncada del receptor HER2 que consiste en la SEQ ID NO: 1 donde dichos medios consisten en al menos un agente según las reivindicaciones 14 ó 15.

17. Kit de diagnóstico y determinación de pronóstico en muestras aisladas de cánceres del tipo que expresa el receptor HER2 o sus variantes truncadas, que comprende medios de detección de la presencia en la muestra de la forma truncada del receptor HER2 que consiste en la SEQ ID NO: 1, donde dichos medios consisten en un sistema fase móvil-fase estacionaria donde se produce la migración diferencial de la forma truncada del receptor HER2 de SEQ ID NO: 1, respecto de la forma completa del citado receptor HER2.

18. Uso de un anticuerpo o de un fragmento del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11 para la preparación de un medicamento.

19. Uso según la reivindicación 19, para la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de cánceres en los se expresa al menos la forma truncada del receptor HER2 que consiste en la SEQ ID NO: 1.

20. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 20, donde el medicamento es para el tratamiento o la prevención de cánceres de mama en mamíferos, incluyendo humanos.

21. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 20, donde el medicamento es para el tratamiento o la prevención de cánceres seleccionados del grupo constituido por cáncer de pulmón, páncreas, colon, estómago, próstata, cabeza y cuello, piel, riñón, testículo, tiroides, vejiga urinaria, útero, vulva, endometrio, ovario, esófago, boca, glándula salivar, laringe, peritoneo, región nasofaríngea, las trompas de Falopio, Wilms, así como linfomas, sarcomas de Swing, sarcoma synovial, meduloblastomas, trofoblásticos, gliomas, glioblastomas, colangiocarcinomas, colesteatoma, condrosarcoma, ependimoma, neurilemmomas, neuromas, rhabdomiosarcomas.

22. Composición farmacéutica destinada al tratamiento de cánceres en los que se expresa al menos la forma truncada del receptor HER2 que contiene la SEQ ID NO: 1, caracterizada porque comprende un anticuerpo o un fragmento del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11 y al menos un excipiente y/o vehículo farmacéuticamente aceptables.

23. Método de obtención de un anticuerpo monoclonal, donde se cultiva la línea celular hibridoma según la reivindicación 12 en un medio de cultivo apropiado y se recupera el anticuerpo monoclonal de este medio.