MÉTODO DE CONTROL DE LA PROLIFERACIÓN Y DIFERENCIACIÓN DE CÉLULAS PROGENITORAS Y MADRE.

Método de control de la proliferación y diferenciación de células progenitoras y madre. Campo y antecedentes de la invención La presente invención se refiere a las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones. Por tanto, se refiere a (1) un método de expansión de células progenitoras y madre hematopoyéticas ex vivo, mientras que al mismo tiempo se inhibe la diferenciación de dichas células progenitoras y madre hematopoyéticas, comprendiendo el método proporcionar a dichas células progenitoras y madre hematopoyéticas ex vivo condiciones para la proliferación celular y un quelante de metales de transición seleccionado del grupo que consiste en tetraetilenpentamina (TEPA), etilendiamina (EDA), pentaetilenhexamina (PEHA), trietilentetramina (TETA), penicilamina y captopril, en el que dichas condiciones para la proliferación celular comprenden nutrientes y al menos una citocina de acción temprana o citocinas de acción temprana, en el que dichas células progenitoras y madre hematopoyéticas son células progenitoras y madre hematopoyéticas terapéuticas, y en el que dicho quelante y dichas condiciones de proliferación dan como resultado (i) proliferación activa prolongada; (ii) expansión a largo plazo de células clonogénicas (CFUc); y (iii) mantenimiento de células indiferenciadas en su estado indiferenciado; con la condición de que dichas células hematopoyéticas no son células madre embrionarias humanas obtenidas de un embrión humano; (2) un método de transducción de células progenitoras y madre hematopoyéticas terapéuticas indiferenciadas, expandidas con un exogén, comprendiendo el método: (a) expandir e inhibir la diferenciación de dichas células progenitoras y madre hematopoyéticas: (i) proporcionando a dichas células progenitoras y madre hematopoyéticas condiciones para la proliferación celular, en el que dichas condiciones para la proliferación celular comprenden nutrientes y al menos una citocina de acción temprana o citocinas de acción temprana y en el que dichas células progenitoras y madre hematopoyéticas son células progenitoras y madre hematopoyéticas terapéuticas; (ii) poniendo en contacto dichas células progenitoras y madre hematopoyéticas con un quelante de metales de transición seleccionado del grupo que consiste en TEPA, EDA, PEHA, TETA, penicilamina y captopril, en el que dicho quelante y dichas condiciones de proliferación dan como resultado proliferación activa prolongada; expansión a largo plazo de células clonogénicas (CFUc); y mantenimiento de células indiferenciadas en su estado indiferenciado; inhibiendo de ese modo la diferenciación y expansión de dichas células hematopoyéticas ex vivo; y (b) transducir dichas células progenitoras y madre hematopoyéticas indiferenciadas, expandidas terapéuticas con el exogén, con la condición de que dichas células progenitoras y madre hematopoyéticas no son células madre embrionarias humanas obtenidas de un embrión humano; (3) una población de células progenitoras y madre hematopoyéticas cultivadas ex vivo terapéuticas que comprende células progenitoras y madre hematopoyéticas indiferenciadas expandidas según los métodos según cualquiera de las reivindicaciones 1-14, teniendo dicha población: (i) una mayor proporción de células progenitoras y madre hematopoyéticas en proliferación; (ii) una mayor proporción de células clonogénicas (CFUc); y (iii) una mayor proporción de células indiferenciadas mantenidas en su estado indiferenciado en comparación con una población similar de células progenitoras y madre hematopoyéticas ex vivo cultivadas sin contacto con dicho quelante de metales de transición; (4) un método de conservación de células progenitoras y madre hematopoyéticas indiferenciadas que comprende poner en contacto las células progenitoras y madre hematopoyéticas indiferenciadas con un quelante de metales de transición seleccionado del grupo que consiste en TEPA, EDA, PEHA, TETA, penicilamina y captopril, en el que dicho contacto se realiza en al menos una de las etapas de recogida, aislamiento y almacenamiento de las células hematopoyéticas indiferenciadas, con la condición de que dichas células hematopoyéticas no son células madre embrionarias humanas obtenidas de un embrión humano; (5) bolsas de recogida de células madre, complementadas con una cantidad de un quelante de metales de transición seleccionado del grupo que consiste en TEPA, EDA, PEHA, TETA, penicilamina y captopril, siendo 2   dicha cantidad suficiente para inhibir la diferenciación de una población de células hematopoyéticas indiferenciadas; (6) el uso de una composición de células hematopoyéticas terapéuticas que comprende una población de células progenitoras y madre hematopoyéticas indiferenciadas expandidas según los métodos según cualquiera de las reivindicaciones 1-14 para la preparación de un medicamento para tratar a un sujeto que necesita el trasplante de células madre hematopoyéticas, en el que dicha población se caracteriza por tener: (i) una mayor proporción de células progenitoras y madre hematopoyéticas en proliferación; (ii) una mayor proporción de células clonogénicas (CFUc); y (iii) una mayor proporción de células indiferenciadas mantenidas en su estado indiferenciado en comparación con una población similar de células progenitoras y madre hematopoyéticas ex vivo cultivadas sin contacto con dicho quelante de metales de transición; (7) una población de células progenitoras y madre hematopoyéticas cultivadas ex vivo terapéuticas que comprende células progenitoras y madre hematopoyéticas indiferenciadas expandidas según los métodos según cualquiera de las reivindicaciones 1-14, proporcionándose dicha población en un medio que comprende dicho quelante de metales de transición. Proliferación y diferenciación celular La producción normal de células sanguíneas (hematopoyesis) implica los procesos de proliferación y diferenciación que están estrechamente acoplados. En la mayoría de las células hematopoyéticas, tras la división, las células hijas experimentan una serie de cambios progresivos que finalmente culminan en células sanguíneas funcionales, totalmente diferenciadas (maduras), que en su mayor parte carecen de potencial proliferativo. Por tanto, el proceso de diferenciación limita y finalmente detiene la división celular. Sólo en una pequeña minoría de las células hematopoyéticas, conocidas como células madre, la división celular puede dar como resultado una progenie que es similar o idéntica a sus células antecesoras. Este tipo de división celular, conocida como autorrenovación, es una propiedad inherente de las células madre y ayuda a mantener una pequeña reserva de células madre en su estado más indiferenciado. Algunas células madre pierden su capacidad de autorrenovación y tras la división celular se diferencian en diversos tipos de progenitores de linaje comprometido que finalmente dan lugar a células maduras. Mientras que estas últimas proporcionan la capacidad funcional del sistema de células sanguíneas, las células madre son responsables del mantenimiento de la hemopoyesis durante toda la vida a pesar de la pérdida continua de las células más diferenciadas a través de apoptosis (muerte celular programada) y/o eliminación activa de células maduras envejecidas por el sistema reticuloendotelial. Tal como se detalla adicionalmente a continuación, la expansión de las células madre y otras subpoblaciones de células linfohemopoyéticas definidas mediante cultivo ex vivo podría tener importantes aplicaciones clínicas. Una variedad de protocolos han sugerido y experimentado para el enriquecimiento de tales poblaciones. Las principales estrategias experimentales empleadas incluyen la incubación de células mononucleares con o sin selección de CD34 + (8); con diferentes cócteles de factores de crecimiento tempranos y tardío (17); con o sin suero (7); en cultivos estacionarios, cultivos con intercambio de medio rápido (18) o en perfusión continua (biorreactores) (6); y con o sin una capa de células estromales establecida (19). Aunque se obtuvo a menudo una expansión significativa de progenitores intermedios y tardíos durante cultivos ex vivo de 7-14 días, la magnitud de células madre hematopoyéticas tempranas (CD34 + CD38 - ) con alto potencial proliferativo habitualmente disminuía (6, 20-22). Por tanto, estos cultivos no dan como resultado una verdadera expansión de células madre, sino en su lugar una proliferación y diferenciación de las células madre en células preprogenitoras, acompañado por un agotamiento de la reserva de células madre primitiva. Con el fin de lograr una expansión ex vivo máxima de células madre, deben cumplirse las siguientes condiciones: (i) la diferenciación debe inhibirse o retrasarse de manera reversible y (ii) la autorrenovación... [Seguir leyendo]

1. Método de expansión de células progenitoras y madre hematopoyéticas ex vivo, mientras que al mismo tiempo se inhibe la diferenciación de dichas células progenitoras y madre hematopoyéticas, comprendiendo el método proporcionar a dichas células progenitoras y madre hematopoyéticas ex-vivo condiciones para la proliferación celular y con un quelante de metales de transición seleccionado del grupo que consiste en tetraetilenpentamina (TEPA), etilendiamina (EDA), pentaetilenhexamina (PEHA), trietilentetramina (TETA), penicilamina y captopril, en el que dichas condiciones para la proliferación celular comprenden nutrientes y al menos una citocina de acción temprana o citocinas de acción temprana, en el que dichas células progenitoras y madre hematopoyéticas son células progenitoras y madre hematopoyéticas terapéuticas, y en el que dicho quelante y dichas condiciones de proliferación dan como resultado (i) proliferación activa prolongada; (ii) expansión a largo plazo de células clonogénicas (CFUc); y (iii) mantenimiento de células indiferenciadas en su estado indiferenciado; con la condición de que dichas células hematopoyéticas no son células madre embrionarias humanas obtenidas de un embrión humano. 2. Método según la reivindicación 1, en el que dicho quelante de metales de transición es TEPA. 3. Método según la reivindicación 1, en el que la concentración de dicho quelante de metales de transición es de 0,1 µM a 100 mM. 4. Método según la reivindicación 3, en el que la concentración de dicho quelante de metales de transición es de 4 µM a 50 mM. 5. Método según la reivindicación 4,en el que la concentración de dicho quelante de metales de transición es de 5 µM a 40 mM. 6. Método según la reivindicación 1, en el que dichas condiciones para la proliferación celular comprenden además proporcionar una citocina de acción tardía o citocinas de acción tardías. 7. Método según la reivindicación 6, en el que dicha citocina de acción tardía se selecciona del grupo que consiste en factor estimulante de colonias de granulocitos, factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos y eritropoyetina. 8. Método según la reivindicación 6, en el que dicha citocina de acción tardía es factor estimulante de colonias de granulocitos. 9. Método según la reivindicación 1, en el que dichas células hematopoyéticas se derivan de una fuente seleccionada del grupo que consiste en células de médula ósea, células de sangre periférica y células de sangre de cordón umbilical neonatal. 10. Método según la reivindicación 1, en el que dichas células progenitoras y madre hematopoyéticas se derivan de células de sangre de cordón umbilical neonatal. 11. Método según la reivindicación 1, que comprende además la etapa de seleccionar una población de células hematopoyéticas enriquecida en células madre hematopoyéticas. 12. Método según la reivindicación 11, en el que dichas células están enriquecidas en CD34+. 13. Método de transducción de células progenitoras y madre hematopoyéticas terapéuticas indiferenciadas expandidas, con un exogén, comprendiendo el método: (a) expandir e inhibir la diferenciación de dichas células progenitoras y madre hematopoyéticas: (i) proporcionando a dichas células progenitoras y madre hematopoyéticas condiciones para la proliferación celular, en el que dichas condiciones para la proliferación celular comprenden nutrientes y al menos una citocina de acción temprana o citocinas de acción temprana y en el que dichas células progenitoras y madre hematopoyéticas son células progenitoras y madre hematopoyéticas terapéuticas; (ii) poniendo en contacto dichas células progenitoras y madre hematopoyéticas con un quelante de metales de transición seleccionado del grupo que consiste en TEPA, EDA, PEHA, TETA, penicilamina y captopril, en el que dicho quelante y dichas condiciones de proliferación dan como resultado proliferación activa prolongada; expansión a largo plazo de células clonogénicas (CFUc); y mantenimiento de células indiferenciadas en su estado indiferenciado; inhibiendo de ese modo la diferenciación y expansión dichas células hematopoyéticas ex vivo; y (b) transducir dichas células progenitoras y madre hematopoyéticas indiferenciadas expandidas terapéuticas, con   el exogén, con la condición de que dichas células progenitoras y madre hematopoyéticas no son células madre embrionarias humanas obtenidas de un embrión humano. 14. Método según la reivindicación 13, en el que dicha transducción se efectúa mediante un vector que incluye el exogén. 15. Población de células progenitoras y madre hematopoyéticas cultivadas ex vivo terapéuticas que comprende células progenitoras y madre hematopoyéticas indiferenciadas expandidas según los métodos según cualquiera de las reivindicaciones 1-14, teniendo dicha población: (i) una mayor proporción de células progenitoras y madre hematopoyéticas en proliferación; (ii) una mayor proporción de células clonogénicas (CFUc); y (iii) una mayor proporción de células indiferenciadas mantenidas en su estado indiferenciado en comparación con una población similar de células progenitoras y madre hematopoyéticas cultivadas ex vivo sin contacto con dicho quelante de metales de transición con la condición de que dichas células hematopoyéticas no son células madre embrionarias humanas obtenidas de un embrión humano. 16. Método de conservación de células progenitoras y madre hematopoyéticas indiferenciadas que comprende poner en contacto las células progenitoras y madre hematopoyéticas indiferenciadas con un quelante de metales de transición seleccionado del grupo que consiste en TEPA, EDA, PEHA, TETA, penicilamina y captopril, en el que dicho contacto se realiza en al menos una de las etapas de recogida, aislamiento y almacenamiento de las células hematopoyéticas indiferenciadas, con la condición de que dichas células hematopoyéticas no son células madre embrionarias humanas obtenidas de un embrión humano. 17. Método según la reivindicación 16, en el que dicho quelante de metales de transición es TEPA. 18. Bolsas de recogida de células madre, complementadas con una cantidad de un quelante de metales de transición seleccionado del grupo que consiste en TEPA, EDA, PEHA, TETA, penicilamina y captopril, siendo dicha cantidad suficiente para inhibir la diferenciación de una población de células hematopoyéticas indiferenciadas. 19. Bolsas de recogida de células madre según la reivindicación 18, en las que dicho quelante de metales de transición es TEPA. 20. Bolsas de recogida de células madre según la reivindicación 18, en las que la concentración de dicho quelante de metales de transición es de 0,1 µM a 100 mM. 21. Bolsas de recogida de células madre según la reivindicación 20, en las que la concentración de dicho quelante de metales de transición es de 4 µM a 50 mM. 22. Bolsas de recogida de células madre según la reivindicación 20, en las que la concentración de dicho quelante de metales de transición es de 5 µM a 40 mM. 23. Uso de una composición de células hematopoyéticas terapéuticas que comprende una población de células progenitoras y madre hematopoyéticas indiferenciadas expandidas según los métodos según cualquiera de las reivindicaciones 1-14 para la preparación de un medicamento para tratar a un sujeto que necesita el trasplante de células madre hematopoyéticas, en el que dicha población se caracteriza por tener: (i) una mayor proporción de células progenitoras y madre hematopoyéticas en proliferación; (ii) una mayor proporción de células clonogénicas (CFUc); y (iii) una mayor proporción de células indiferenciadas mantenidas en su estado indiferenciado en comparación con una población similar de células progenitoras y madre hematopoyéticas ex vivo cultivadas sin contacto con dicho quelante de metales de transición. 24. Métodos según las reivindicaciones 1 y 13, en los que dicha al menos una citocina de acción temprana o citocinas se seleccionan del grupo que consiste en factor de células madre, ligando FLT3, interleucina 6, trombopoyetina e interleucina 3. 25. Métodos según las reivindicaciones 1 y 13, en los que dicha citocina de acción temprana es ligando FLT3. 26. Población de células progenitoras y madre hematopoyéticas cultivadas ex vivo terapéuticas que comprende células progenitoras y madre hematopoyéticas indiferenciadas expandidas según los métodos según cualquiera de las reivindicaciones 1-14, proporcionándose dicha población de células en un medio que comprende dicho quelante de metales de transición con la condición de que dichas células hematopoyéticas no son células madre embrionarias humanas obtenidas de un embrión humano. 21   22   23   24     26   27   28   29     31   32   33   34     36   37   38