Un procedimiento para la purificación de una preparación que comprende glicoproteína rica en histidina (HRGP),

que comprende las etapas de (i) preparar una solución que comprende principalmente AT-III y glicoproteína rica en histidina (HRGP); (ii) poner en contacto dicha solución con un gel de intercambio de cationes en el que el grupo intercambiador de cationes está fijado a la matriz del gel a través de una cadena polimérica lineal, en condiciones en las que la AT­ III puede eluirse del gel a una potencia iónica baja, mientras que la HRGP está unida al gel a una potencia iónica baja; (iii) eluir en condiciones de potencia iónica media o alta y recoger la fracción de proteína fijada al gel de intercambio de cationes

Campo técnico

La presente invención se refiere a procedimientos para separar las isoformas AT-III de glicoproteína rica en histidina (HRGP).

Técnica antecedente

La antitrombina III (AT-III) es una glicoproteína del plasma que inhibe las serina proteasas en la cascada de coagulación y, de esta manera, desempeña un papel fundamental en la regulación de la coagulación sanguínea. La antitrombina III es un inhibidor de los factores IXa, Xa, XI, XIIa y trombina. De esta manera, AT-III regula la formación de coágulos en diferentes fases de la cascada de coagulación. Una pequeña disminución del contenido de AT-III en la sangre está asociada con un aumento del riesgo de tromboembolia. Se usan concentrados de AT-III en la profilaxis y tratamiento de trastornos tromboembólicos en pacientes con deficiencia de antitrombina adquirida o hereditaria. Además, se ha informado de que AT-III está implicada en muchas otras respuestas biológicas, por ejemplo angiogénesis y respuestas inflamatorias. La función de AT-III en estos mecanismos aún no se entiende completamente.

La purificación de AT-III por cromatografía de afinidad, usando heparina como ligando de unión en fase sólida, se conoce en la técnica. Miller-Andersson y col. (Thrombosis Research 5, 439-452, 1974) desvelan el uso de heparina-Sepharose para purificar AT-III humana. Todo el procedimiento, que incluye intercambio de iones y cromatografía de filtración en gel, proporcionaba un rendimiento del 34 %.

En plasma humano, la antitrombina III existe como al menos dos entidades moleculares, que son homólogas de acuerdo con la composición de aminoácidos, aunque difieren en el contenido de carbohidrato y en su comportamiento de unión a heparina. Una variante de antitrombina, denominada AT-III, se aisló del plasma humano, independientemente de la especie de antitrombina predominante (denominada AT-III), gracias a su fuerte unión a la matriz de heparina-Sepharose a potencias iónicas altas (Peterson, C.B. & Blackbum, M.N. (1985) J. Biol. Chem. 260, 610-615).

Los pesos moleculares determinados fueron 59.800 y 56.900 para AT-III y AT-III humanas, respectivamente. La diferencia en los pesos moleculares de las dos antitrombinas se atribuyó a una reducción de aproximadamente el 25-30 % en el contenido de ácido siálico, azúcar neutro y amino azúcar en AT-III, si se compara con el contenido de carbohidrato de la subespecie AT-III (Peterson & Blackburn, supra). Se ha demostrado que AT-III carece de uno de las cuatro cadenas laterales de oligosacárido, en concreto la cadena lateral en asparagina 135 (Brennan,

S.O. y col. (1987) FEBS Letters 219, 431-436). La forma AT-III está cargada más negativamente que AT-III; se ha demostrado que AT-III y AT-III tienen una pl:s de 4,9 y 5,1, respectivamente (Frebelius, S. y col. (1996) Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 16:1292-1297).

Es deseable obtener AT-III pura, puesto que esta forma tiene efectos específicos sobre la coagulación en la pared del vaso. Se ha demostrado que AT-III puede evitar la reestenosis de aorta de conejo después de una lesión con globo (Swedenborg (1998) Blood Coagulation and Fibrinolysis 9 (supl. 3): S7-S10). Por lo tanto, puede considerarse AT-III como un fármaco potencial para seres humanos en la profilaxis de la reestenosis cuando se realiza dilatación con de la aorta con un globo.

La glicoproteína rica en histidina (HRGP) es una proteína del plasma monocatenaria, aislada originalmente en 1972. La función fisiológica exacta de HRGP aún es desconocida. Debido a la interacción con heparina, fibrinógeno y fibrina, plasminógino y plaquetas activadas, se considera que la HRGP es un modulador de la coagulación y fibrinolisis (Koide, T. En: Fibrinolysis: Current Prospects. Gaffney, PJ (Ed.), John Libbey & Co., Londres 1988, pág. 55-63). La cadena polipeptídica consiste en 507 restos de aminoácido y contiene regiones que comparten homología con otras proteínas del plasma, por ejemplo antitrombina-III (Koide, T. y col. (1986) Biochemistry 25, 2220-2225).

Weitzhandler y col. desarrollaron envases de columna de intercambio de cationes que están basados en un soporte polimérico pelicular, revestido, hidrófilo con una química superficial tentacular artesana, que se aplicó para la separación de citocromo C y variantes de hemoglobina (Weitzhandler y col., Journal of Chromatography A 828, 365372).

Un procedimiento para la preparación de AT-III a partir de plasma sanguíneo se describió en el documento US 5.116.962, que está basado en el uso de un polisacárido sulfatado oxidado, unido a un material de soporte que tiene grupos amino.

Como se ha indicado anteriormente, la implicación completa de las dos isoformas de AT-III y HRGP en el cuerpo aún no se entiende completamente. En consecuencia, es deseable proporcionar procedimientos de purificación eficaces para producir las proteínas en forma pura, que facilitará estudios in vivo e in vitro.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un enfoque isoeléctrico de muestras de proteína recogidas durante procedimientos de acuerdo con la invención (Ejemplo 1) o el procedimiento para comparación (Ejemplo 2).

Gel A

1 Concentrado UF1 (Ejemplo 1, etapa 2)

2 Fracción A1 (Ejemplo 1, etapa 2)

3 Fracción B1 (Ejemplo 1, etapa 2)

4 -

5 Fracción A2 (Ejemplo 1, etapa 3)

6 Fracción de lavado entre A2 y B2 (Ejemplo 1, etapa 3)

7 Fracción B2 (Ejemplo 1, etapa 3)

8 Material eluido del gel con NaCl 1 M (Ejemplo 1, etapa 3)

Gel B

1 Fracciones combinadas B1 y B2 (Ejemplo 1, etapa 4)

2 Material eluido a una potencia iónica baja (Ejemplo 1, etapa 4)

3 Fracción B3 (primera parte del pico de elución) (Ejemplo 1, etapa 4)

4 Fracción B3 (última parte del pico de elución) (Ejemplo 1, etapa 4)

5 Fracción A2 (Ejemplo 1, etapa 3)

6 Fracción B3 (Ejemplo 1, etapa 4)

7 Fracción D (Ejemplo 2)

8 Fracción E (Ejemplo 2)

La Figura 2 es una comparación de los cromatogramas obtenidos a partir de (A) purificación de AT-III mediante cromatografía de intercambio de cationes de acuerdo con el Ejemplo 2 (Fracción A2); y (B) purificación de AT-III mediante cromatografía con heparina-Sepharose de acuerdo con procedimientos conocidos (Fracción D).

Divulgación de la invención

Se ha demostrado, sorprendentemente, que un gel de intercambio de cationes de tipo “tentáculo”, en el que los grupos intercambiadores de cationes están fijados a la matriz del gel a través de una cadena polimérica lineal, pueden usarse ventajosamente para la separación de glicoproteína rica en histidina (HRGP) de antitrombina. Dicho gel de intercambio de cationes puede usarse convenientemente para la purificación, por ejemplo, mediante cromatografía en columna de HRGP.

La divulgación de la presente invención proporciona un procedimiento para la preparación de una solución que comprende antitrombina-III (AT-III) sustancialmente pura, o una isoforma de la misma, comprendiendo dicho procedimiento el uso de un gel de intercambio de cationes, en el que el grupo intercambiador de cationes está fijado a la matriz del gel a través de una cadena polimérica lineal.

Se desvela adicionalmente mediante la invención un procedimiento para la preparación de una solución que comprende antitrombina-III (AT-III) sustancialmente pura, que comprende las etapas de

(i) preparar una solución que comprende principalmente AT-III y glicoproteína rica en histidina (HRGP);

(ii) poner en contacto dicha solución con un gel de intercambio de cationes, en el que el grupo intercambiador de cationes está fijado a la matriz del gel mediante una cadena polimérica lineal, en condiciones en las que ATIII puede eluirse del gel a una potencia iónica baja, mientras que HRGP está fijada al gel a una potencia iónica baja; y

(iii) eluir, en condiciones de potencia iónica baja y recoger una fracción de proteína, obteniendo de esta manera una solución que comprende AT-III sustancialmente pura.

La solución que comprende principalmente AT-III y glicoproteína... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para la purificación de una preparación que comprende glicoproteína rica en histidina (HRGP), que comprende las etapas de

(i) preparar una solución que comprende principalmente AT-III y glicoproteína rica en histidina (HRGP); (ii) poner en contacto dicha solución con un gel de intercambio de cationes en el que el grupo intercambiador de cationes está fijado a la matriz del gel a través de una cadena polimérica lineal, en condiciones en las que la ATIII puede eluirse del gel a una potencia iónica baja, mientras que la HRGP está unida al gel a una potencia iónica baja;

(iii) eluir en condiciones de potencia iónica media o alta y recoger la fracción de proteína fijada al gel de 10 intercambio de cationes.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la etapa de intercambio de cationes se realiza mediante cromatografía en columna.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la etapa de intercambio de cationes se realiza a un pH de 6,5 a 8.

15 4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha solución que comprende principalmente ATIII y HRGP se prepara mediante un procedimiento que comprende las etapas de

(i) preparar un sobrenadante de la fracción I de Cohn a partir de plasma humano;

(ii) poner en contacto dicho sobrenadante de la fracción I de Cohn con un gel de afinidad capaz de unir AT-III y

HRGP; y 20 (iii) eluir y recoger la fracción de proteína unida a dicha matriz de afinidad.

5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicho gel de afinidad comprende heparina como el ligando de afinidad.

6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la HRGP se eluye del gel de intercambio de cationes con un tampón que tiene la conductividad de 10 a 450 mS/cm a temperatura ambiente.

25 7. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho intercambiador de cationes es un intercambiador de cationes fuertemente ácido.

8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicho intercambiador de cationes fuertemente ácido tiene un grupo sulfónico como su grupo funcional.

9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que dicha cadena polimérica lineal consiste en 30 unidades repetidas de la fórmula

**(Ver fórmula)**

en la que x es de 2 a 100; y R1 es alquilo C1-10 ramificado o no ramificado, sustituido con sulfonilo.

10. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que dicho alquilo C1-10 es isobutilo.