PROCEDIMIENTO PARA LA OBTENCIÓN DE UN CONCENTRADO DE FACTOR VON WILLEBRAND O DEL COMPLEJO DE FACTOR VIII/FACTOR VON WILLEBRAND Y UTILIZACIÓN DE LOS MISMOS.

Procedimiento para la obtención de un concentrado de factor von Willebrand o del complejo Factor VIII/Factor von Willebrand,

de origen humano o recombinante, caracterizado por: a) preparación de una solución de (1) Factor von Willebrand o de (2) complejo de Factor VIII/ Factor von Willebrand que contiene FVW a una concentración de hasta 12 UI FVWRCo/ml y una proporción entre Factor von Willebrand/Factor VIII superior o igual a 0,4; b) proceder a la nanofiltración de la solución preparada en a) mediante un filtro de 20 nanómetros, a una presión máxima menor o igual a 0,5 bar, en presencia de ión calcio y a un pH superior a 5,5

1- Ámbito de la invención

La presente invención se refiere a un concentrado terapéutico del Factor von Willebrand o del complejo Factor VIII/Factor von Willebrand y al proceso para la preparación de un medicamento indicado para el tratamiento de la enfermedad de von Willebrand (EVW) y la Hemofilia A que se ha nanofiltrado por un tamaño de poro de 20 nm, lo cual permite la eliminación eficaz tanto de virus con envoltura como sin envoltura, como, por ejemplo, la hepatitis A o el eritrovirus B19.

2-‘ Antecedentes

El Factor von Willebrand (FVW) es una proteína plasmática de estructura multimérica en la que el peso molecular de las diferentes formas varía entre aproximadamente los 230000 Daltons (Da) de cada subunidad monomérica hasta más de 20 millones de Da de las formas multiméricas de mayor peso molecular, constituyendo así la mayor proteína soluble conocida. Su concentración en plasma se sitúa aproximadamente en torno a 5 - 10 μg/ml [Siedlecki y otros, Blood, vol 88, n 8, 1996: 2939-2950] y la forma plasmática de menor tamaño es la correspondiente al dímero, con un tamaño aproximado de 500000 Da.

El FVW desarrolla un papel primordial en la hemostasia primaria, siendo responsable de la adhesión plaquetar sobre las superficies vasculares dañadas y por tanto de la formación del tapón plaquetar, sobre el que se desarrollarán los mecanismos de formación del coágulo de fibrina. Se sugiere que los multímeros de mayor peso molecular soportan con mayor eficacia los mecanismos de adhesión plaquetar al subendotelio y se ha relacionado la eficacia clínica de los concentrados de FVW con el contenido de estos multímeros de mayor peso molecular [Metzner y otros, Haemophilia (1998) 4, 25-32].

Además, en el plasma, el FVW ejerce el papel de transportador y estabilizador del Factor VIII (FVIII), encontrándose en estado nativo la molécula de FVIII unida a las formas multiméricas del FVW. El complejo Factor VIII/Factor von Willebrand (FVIII/FVW) alcanza una longitud que puede llegar a los 1150 nm [Furuya K y otros, Vox Sanguinis (2006) 91, 119-125]. Por otra parte, el FVW en su forma globular más pequeña tendría un tamaño de aproximadamente 149 x 77 x 3,8 nm pudiendo variar su estructura, dependiendo de la fuerza de cizalla, a una forma extendida o lineal [Siedlecki y otros, Blood (1996) 88, 2939-2950]. La concentración plasmática del FVIII se sitúa aproximadamente en torno a 0,05 – 0,1 μg/ml (por lo que es unas 50 a 100 veces inferior a la del FVW).

Defectos cuantitativos o cualitativos del FVW producen alteraciones en la hemostasia primaria, conocidas como enfermedad de von Willebrand, que se manifiesta en problemas hemorrágicos.

Los concentrados purificados de FVW y los concentrados de FVIII con elevado contenido en FVW funcional, presentan utilidad terapéutica en el tratamiento de la enfermedad de von Willebrand.

Otro aspecto a considerar es que al ser el FVW el estabilizante natural del FVIII, los concentrados de FVIII con alto contenido en FVW, cuando se emplean para el tratamiento de la Hemofilia A, pueden presentar numerosas ventajas, como han apuntado algunos autores, por ejemplo: una mayor vida media “in vivo” del FVIII infundido, un efecto protector frente a los anticuerpos inhibidores del FVIII [Gensana M. y otros, Haemophilia, (2001) v.7, 369-374] [Bjorkman S. y otros, Clin Pharmacokinet, (2001) v.40, 815-832] [Behrmann K. y otros, Thromb Haemost, (2002) v.88, 221-229] y una posible menor frecuencia de desarrollo de anticuerpos inhibidores de la actividad del FVIII [Goudemand J. y otros, Blood (2006) 107: 46 – 51].

Se han establecido técnicas analíticas para caracterizar tanto el contenido como la actividad del FVW en estos concentrados. La determinación de la actividad del FVW como cofactor de Ristocetina (FVW:RCo) es uno de los métodos ampliamente usados para la determinación de la actividad del FVW [Heath y otros, Thromb Haemost 1992; 68:155-159]. La medida del antígeno de FVW (FVW:Ag) [Cejka J. Clin Chem. 1982; 28:1356-1358] nos muestra la cantidad de FVW, tanto activo como inactivo, en una muestra.

Uno de los parámetros relevantes para la estimación de la calidad funcional de los concentrados de FVW es la relación entre actividad FVW:RCo y antígeno FVW:Ag.

Dada la posible importancia de la estructura multimérica del FVW y de los multímeros de alto peso molecular en relación a su actividad y eficacia clínica, la caracterización de esta estructura multimérica es fundamental para determinar la utilidad de los concentrados de FVW y de los concentrados de FVIII con elevado contenido en FVW. Esta estructura multimérica se determina por electroforesis en gel [Ruggeri y otros, Blood 1981; 57:1140-1143].

Se han descrito diversos métodos de purificación del FVW o del complejo FVIII/FVW en el que el FVW es funcional y a una concentración suficiente para su uso como producto terapéutico en la EVW, como muestran las patentes EP 0411810 y EP 0639203 o la publicación de Ristol P. y otros, Sangre (1996) 41:125-130.

Otros procesos de purificación de FVIII consiguen un producto final sin FVW o con un contenido de éste a nivel de trazas. Estos concentrados no son aptos para el tratamiento de la EVW. Además, en algunos casos el FVW residual contenido en estos concentrados de FVIII no es funcional, habiendo perdido parte de los multímeros que lo forman, especialmente los de mayor peso molecular. Por tanto, estos concentrados no poseerían las ventajas que tienen los concentrados de FVIII ricos en FVW cuando se emplean para el tratamiento de la Hemofilia A.

En el registro de concentrados de factores de coagulación, creado en 1997 y actualizado por la Federación Mundial de Hemofilia (FMH) en 2006 (Kasper,C.K.; Brooker,M. Registry of clotting factor concentrates, January 2006), se relacionan (tablas 2 y 3) los concentrados de FVIII existentes, especificando, entre otros, el método de fraccionamiento, la inactivación viral, su contenido en FVW y la funcionalidad del mismo.

De entre los concentrados de FVIII nanofiltrados debemos diferenciar los que son nanofiltrados por 35 nm (o tamaño de poro superior), en los que esta nanofiltración no presenta eficacia frente a virus no envueltos, como por ejemplo el virus de la hepatitis A (de aproximadamente 24 nm) o el virus B19 (de entre 18 y 24 nm). Por otra parte los concentrados de FVIII nanofiltrados por tamaños de poro inferior a 35 nm no presentan contenido en FVW, o si lo presentan, éste carece de los multímeros de alto peso molecular, con lo cual no son eficaces para el tratamiento de la EVW y no poseen las ventajas que tienen los concentrados de FVIII ricos en FVW cuando se emplean para el tratamiento de la Hemofilia A.

Una gran capacidad de eliminación de agentes patógenos es imprescindible para asegurar la seguridad de los productos biológicos, por ello en los procesos de producción se incorporan diversos métodos con esta finalidad. Entre ellos cabe citar los tratamientos químicos de inactivación, basados en la acción de solventes orgánicos asociados a un detergente, que han demostrado gran eficacia frente a virus con envoltura lipídica pero que no presentan eficacia contra virus sin envoltura lipídica. Otros tratamientos físicos, como los tratamientos térmicos, son efectivos independientemente de la presencia o no de envuelta lipídica pero su eficacia depende de la severidad del tratamiento, la cual está condicionada a su vez por la resistencia a la inactivación de la proteína a tratar. Otras técnicas que contribuyen a la reducción de la carga viral consisten en separaciones por precipitación o cromatografía.

Un método que se ha mostrado muy efectivo en la eliminación de virus, independientemente de la presencia o no de envuelta lipídica, es la filtración por filtros de un tamaño de poro capaz de retener partículas víricas (nanofiltración). Este método se ha mostrado también eficaz en la eliminación de otras partículas infecciosas como los priones. A pesar de ello, la eficacia de este método está condicionada por el tamaño de poro aplicado, que se define, esencialmente, en función del tamaño de la proteína a filtrar.

Existen nanofiltros de diferentes tamaños de poro, normalmente entre 15 y 75 nanómetros (nm) y en general, a menor tamaño de poro mayor eficacia en la retención de patógenos, siendo los nanofiltros de poro inferior a 35 nm y preferentemente entre 15 y 20 nm los que consiguen retener los virus más pequeños, cuyo tamaño se sitúa entre los 18 y 23 nm, como... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la obtención de un concentrado de factor von Willebrand o del complejo Factor VIII/Factor von Willebrand, de origen humano o recombinante, caracterizado por:

a) preparación de una solución de (1) Factor von Willebrand o de (2) complejo de Factor VIII/ Factor von Willebrand que contiene FVW a una concentración de hasta 12 UI FVWRCo/ml y una proporción entre Factor von Willebrand/Factor VIII superior o igual a 0,4;

b) proceder a la nanofiltración de la solución preparada en a) mediante un filtro de 20 nanómetros, a una presión máxima menor o igual a 0,5 bar, en presencia de ión calcio y a un pH superior a 5,5.

2. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado por que la concentración de ión calcio en la solución sometida a nanofiltración varía entre 0,05 y 0,2 M.

3. Procedimiento de nanofiltración, según las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado por que el Factor von Willebrand recuperado después de la nanofiltración mantiene una estructura multimérica que incluye multímeros del orden de 11 ó superior.

4. Procedimiento de nanofiltración, según las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la recuperación del Factor von Willebrand después de la nanofiltración es mayor o igual al 60%.

5. Procedimiento de nanofiltración, según las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la recuperación del Factor VIII después de la nanofiltración es mayor o igual al 70%.

6. Procedimiento de nanofiltración, según las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que se aplica una relación de carga hasta 50 UI de Factor von Willebrand por cm2 de superficie filtrante.

7. Procedimiento de nanofiltración, según las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la concentración máxima de la solución a filtrar es de 0,6 UA (DO280).

8. Procedimiento de nanofiltración, según las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la nanofiltración se realiza a una presión entre 0,2 y 0,4 bar.

9. Procedimiento de nanofiltración, según las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el caudal normalizado de nanofiltración se sitúa entre 10 y 20 litros/hora/m2.