GRUPO DE PATRONES Y MÉTODO DE PRODUCCIÓN.

Proceso de formación de un grupo de patrones o más que contienen un número definido de partículas seleccionadas de una célula,

un microorganismo o un pequeño objeto detectable por citometría de flujo, comprendiendo el proceso: contar y capturar un número definido de partículas de entre 2000

Existen muchos procedimientos realizados que implican la manipulación de pequeñas partículas tales como células, bacterias, levaduras, hongos, virus, protozoos, espermatozoides, óvulos, embriones, larvas, polen, perlas, partículas de tinta y similares. En general, la manipulación de pequeñas partículas es de por sí difícil debido a que las partículas son demasiado pequeñas para ser visualizadas a simple vista.

En el caso en el que se realiza un procedimiento que consiste en añadir pequeñas partículas a un depósito (por ejemplo, un tubo de ensayo) en general no hay disponible una tecnología sencilla que permita saber exactamente, o al menos con un grado mínimo de error, cuántas partículas se han añadido. Por lo general, se prepara una suspensión de partículas y a continuación, se analiza la suspensión (por ejemplo, enumeración por microscopía o cultivo en una placa de agar) para estimar el número de partículas por volumen de líquido. Después se utiliza una alícuota de esta suspensión, que contiene un número estimado de partículas, sin conocerse el número exacto de partículas en la alícuota.

Existen varios dispositivos disponibles que pueden dispensar con exactitud un pequeño volumen de líquido. Habitualmente para este fin se utilizan pipetas que pueden dispensar con precisión y fiabilidad volúmenes que oscilan entre 0.0001 ml y 20 ml. Cuando se utiliza una pipeta para manipular pequeñas partículas tales como células, el número real de células dentro del volumen de fluido que se está dispensando se desconoce y no puede controlarse. Sólo se puede controlar el volumen de líquido.

Los dispositivos tales como pipetas funcionan muy bien para dispensar fluidos que contienen sustancias químicas o moléculas solubles en solución. Esto se debe a que las sustancias químicas o las moléculas solubles se dispersan uniformemente en el fluido (es decir, se disuelven). Este no es el caso de partículas tales como las células. Las partículas normalmente se distribuyen por el fluido de manera aleatoria. Esto significa que dos volúmenes iguales de fluido tomados de una suspensión de partículas no van a contener el mismo número de partículas. Por tanto, los dispositivos tales como pipetas no pueden dispensar un número conocido de partículas con un alto grado de exactitud y precisión. Por ello, se necesitan métodos que puedan utilizarse para dispensar con precisión un número conocido de partículas tales como células o microorganismos.

La citometría de flujo es una técnica que puede utilizarse para dispensar partículas. La citometría de flujo se puede utilizar para seleccionar físicamente partículas tales como células, utilizando información procedente de diferentes detectores tales como discriminadores. La selección permite la purificación de un tipo particular de partículas de una mezcla. Sin embargo, los citómetros de flujo por lo general seleccionan una partícula cada vez.

El método estándar de selección de partículas por citometría de flujo se conoce como selección de desviación de gotas. Se basa en el uso de un transductor piezoeléctrico en la celda de flujo para crear gotas de fluido envolvente. Una corriente eléctrica alterna pasa a través del transductor haciendo que la celda de flujo vibre hacia arriba y hacia abajo en la misma frecuencia que la corriente. La vibración de la celda de flujo produce ondulaciones que se forman en el fluido envolvente, una vez que ha salido de la celda de flujo. Corriente abajo de la celda de flujo, las ondulaciones que están en la corriente del fluido envolvente se definen cada vez más hasta que la corriente se descompone en gotas. La última ondulación en la corriente antes de que el flujo se descompone en gotas, se conoce como la última gota pegada.

Si se va a recoger una partícula, se coloca una carga eléctrica en el fluido envolvente en el momento exacto en el que la partícula está en la última gota pegada. La carga se produce en el transcurso de la duración de una vibración del cristal piezoeléctrico. Esto da como resultado que sólo se carga una gota, la que contiene la partícula que se va a seleccionar. Más corriente abajo de la celda de flujo, la corriente de gotas pasa entre dos placas, una con carga positiva y otra con carga negativa. A medida que la gota cargada pasa entre las placas, se desvía de la corriente principal de gotas, lo que permite recogerla.

Este proceso de selección se puede realizar a una velocidad de varios miles de veces por segundo utilizando un citómetro moderno.

Sin embargo, los citómetros de flujo que utilizan la selección de desviación de gotas, son instrumentos caros, grandes y complejos que requieren que un operario altamente cualificado los alinee como mínimo una vez al día. El ajuste de la selección también es difícil y requiere una serie de calibraciones, incluido el cálculo del tiempo que tarda una partícula en desplazarse desde la zona de interacción a la última gota pegada. Este período de tiempo se conoce como retraso de gotas. Una vez establecida la selección, se tiene que vigilar de cerca para asegurarse de que el retraso de gotas no cambie.

Una limitación de la selección de desviación de gotas consiste en que no puede crear gotas que contengan más de una partícula. Otro problema con la selección de desviación de gotas consiste en que puede crear aerosoles y por tanto no es apta para el análisis de condiciones biológicamente duras que no son especialmente adecuadas para mantener la viabilidad o integridad de células vivas. Las dificultades con el uso de la selección de retraso de gotas consisten en que restringe el uso de la tecnología a los laboratorios de investigación especializados.

Una forma alternativa de selección de citometría de flujo se describe en la patente U.S. 5030002 "Método y aparato para clasificar partículas con un tubo de captura móvil". Este proceso de selección utiliza un tubo de captura que entra y sale mecánicamente de la corriente de muestra para capturar una partícula. Esto permite al sistema seleccionar partículas mediante la detección de ciertas propiedades de las partículas y después guiar las partículas de una en una hasta el recipiente o el recipiente de residuos. Por ejemplo, este proceso de selección lo utiliza el citómetro de flujo FACScalibur Becton Dickinson. Este citómetro de flujo es simple de manejar y no requiere calibración o un proceso de puesta a punto complejo antes de la selección de partículas. Consiste simplemente en encender el instrumento, analizar una muestra y seleccionar las partículas de interés.

Sin embargo, una limitación de este tipo de citómetro de flujo de selección es la velocidad a la que se pueden seleccionar partículas. El tubo de captura normalmente puede entrar y salir de la corriente de partículas a una velocidad de 300 veces por segundo. El sistema está diseñado para seleccionar una partícula cada vez. Por ello, el número máximo de partículas que se pueden seleccionar por segundo con estos citómetros del estado de la técnica es 300.

El presente solicitante ha sido capaz de producir patrones con un número exacto muy pequeño (menos de 1.000 y por lo general alrededor de 100 o menos) de microorganismos (U.S. 6.780.581; WO 2003/02095). Desafortunadamente, el proceso utilizado para hacer estos patrones no puede producir patrones con más de aproximadamente 1.000 microorganismos. Aunque desde hace tiempo se necesitan patrones con un número exacto de partículas de hasta cerca de 1.000.000, tales patrones no se pueden producir a una escala comercial razonable. Como resultado de las limitaciones de los dispositivos de medición existentes, no ha sido posible producir números exactos relativamente altos de partículas tales como células o microorganismos, para su uso como patrones o controles. Chang et al. Jim 1998, vil. 211, págs. 51-63 prepararon patrones con hasta 1.000 partículas

Los presentes inventores han desarrollado métodos para producir patrones exactos y reproducibles con 2.000 a 1.000.000 de partículas.

Breve descripción de la invención

En un primer aspecto, la presente descripción proporciona un grupo de 10 o más patrones que contienen un número definido de partículas de entre 1000 y 1.000.000, en donde el número definido de partículas está dentro de un grado de error del 10% o menos entre cada patrón...

1. Proceso de formación de un grupo de 10 patrones o más que contienen un número definido de partículas seleccionadas de una célula, un microorganismo

o un pequeño objeto detectable por citometría de flujo, comprendiendo el

proceso: contar y capturar un número definido de partículas de entre 2.000 y

1.000.000 mediante un citómetro de flujo que identifique y cuente partículas y coloque un tubo de captura en una corriente que contiene las partículas para capturar el número definido de partículas, teniendo el citómetro de flujo una unidad de discriminación digital (SDU) que recibe las señales de dispersión hacia adelante y las señales de dispersión lateral para identificar y contar las partículas y controlar la colocación del tubo de captura, en donde el tubo de captura se mantiene en posición en la corriente hasta la captura de un número definido de partículas,

recoger el número definido de partículas capturadas en una gota distribuida por el tubo de captura; y

repetir los pasos que consisten en contar, capturar y recoger para formar un grupo de patrones, en donde el número definido de partículas está dentro de un grado de error del 10% o menos entre cada patrón del grupo.

2. Proceso según la reivindicación 1, en donde la célula se selecciona de espermatozoides, óvulos, células madre, no siendo las células madre de embriones humanos, células vegetales, polen, huevos, larvas, esporas o sus mezclas y el microorganismo se selecciona a partir de bacterias, hongos, levaduras, virus, protozoos priones, o sus mezclas.

3. Proceso según la reivindicación 2, en donde el microorganismo se selecciona de Legionella, Salmonella, leptospirosis, Saccharomyces, Clostridium, Vibrio, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, Staphylococcus, Campylobacter, Aspergillus, Candida, Enterobacter, Enterococcus, Listeria, Salmonella, Pseudomonas, Lactobacillus, Citrobacter, Proteus, Lactococcus, Klebsiella, Aeromonas, Zygosaccharomyces, Acinetobacter, Serratia, Edwardsiella, Rhodococcus, Yersinia, Methylobacterium, Haemophilus, Gardnerella,

micobacterias, Bordetalla, Haemophilus, Shigella, Kluyvera, Spirochaeta, Rhizobium, Rhizobacter, Brucella, Neisseria, Rickettsias, Chlamidia, o sus mezclas.

4. Proceso según la reivindicación 3, en donde el microorganismo se selecciona de Cryptosporidium, Giardia, Cyclospora, Toxoplasma, Eimeria, y sus mezclas.

5. Proceso según la reivindicación 1, en donde el pequeño objeto se selecciona de perlas, partículas minerales, partículas magnéticas, partículas de tinta, liposomas, partículas metálicas, nanomáquinas, nanoestructuras, nanorobots, partículas secas, cristalizadadas o particularizadas de material biológico, o sus mezclas.

6. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el número definido de partículas oscila entre 2.000 y 500.000.

7. Proceso según la reivindicación 6, en donde el número definido de partículas oscila entre 5.000 y 100.000.

8. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el grupo de patrones se presenta en forma líquida, congelada o sólida.

9. Proceso según la reivindicación 8, en donde la forma sólida es una perla o una bola que contiene el número definido de partículas.

10. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el grado de error oscila entre el 1% y el 10%.

11. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el patrón se puede transferir entre recipientes en una forma sólida y puede liberar las partículas en un líquido.

12. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el grupo de patrones contiene entre 10 y 1.000 patrones o contiene 20 patrones o

contiene 50 patrones, o contiene 100 patrones, o contiene 500 patrones, o contiene 1.000 patrones.

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