Un polipéptido aislado de Corynebacterium glutamicum, estando implicada dicha proteína en el metabolismo de metionina y lisina y comprendiendo la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:2

Genes de Corynebacterium glutamicum que codifican proteínas del camino metabólico.

Antecedentes de la invención

Ciertos productos y subproductos de procesos metabólicos existentes naturalmente en las células tienen utilidad en una serie extensa de industrias, que incluyen las industrias alimentaria, de los piensos, de los cosméticos, y farmacéutica. Estas moléculas, denominadas colectivamente "productos químicos finos", incluyen ácidos orgánicos, aminoácidos tanto proteinógenos como no proteinógenos, nucleótidos y nucleósidos, lípidos y ácidos grasos, dioles, carbohidratos, compuestos aromáticos, vitaminas y cofactores, así como enzimas. Su producción se realiza muy convenientemente por cultivo en gran escala de bacterias desarrolladas para producir y secretar grandes cantidades de una molécula particular deseada. Un organismo particularmente útil para este propósito es Corynebacterium glutamicum, una bacteria gram-positiva no patógena. Por selección de cepas, se han desarrollado cierto número de cepas mutantes que producen un conjunto de compuestos deseables. Sin embargo, la selección de las cepas implicadas para la producción de una molécula particular es un proceso difícil y que consume mucho tiempo.

Sumario de la invención

La invención proporciona una nueva molécula de ácido nucleico bacteriano que tiene una diversidad de usos. Estos usos incluyen la identificación de microorganismos que pueden utilizarse para producir aminoácidos, tales como lisina y metionina, la modulación de dicha producción en C. glutamicum o bacterias emparentadas, la tipificación o identificación de C. glutamicum o bacterias afines, como puntos de referencia para el mapeado del genoma de C. glutamicum, y como marcadores para transformación. Esta nueva molécula de ácido nucleico codifica una proteína, a la que se hace referencia en esta memoria como proteína del camino metabólico (MP).

C. glutamicum es una bacteria aerobia gram-positiva que se utiliza comúnmente en la industria para la producción en gran escala en una diversidad de productos químicos finos, y también para la degradación de hidrocarburos (por ejemplo en vertidos de petróleo) y para la oxidación de terpenoides. La molécula de ácido nucleico MP de la invención, por consiguiente, puede utilizarse para identificar microorganismos que pueden ser utilizados para producir productos químicos finos, v.g., por procesos de fermentación. La modulación de la expresión del ácido nucleico MP de la invención, o la modificación de la secuencia de la molécula de ácido nucleico MP de la invención, pueden utilizarse para modular la producción de uno o más productos químicos finos a partir de un microorganismo (v.g., para mejorar el rendimiento o la producción de uno o más productos químicos finos a partir de una especie de Corynebacterium o Brevibacterium). En una realización preferida, el gen MP de la invención está combinado con uno o más genes implicados en el mismo camino metabólico o un camino diferente para modular la producción de los aminoácidos mencionados anteriormente, a partir de un microorganismo.

El ácido nucleico MP de la invención puede utilizarse también para identificar un organismo como Corynebacterium glutamicum o como un miembro de la misma familia, o para identificar la presencia de C. glutamicum o un organismo afín del mismo en una población mixta de microorganismos. La invención proporciona la secuencia de ácido nucleico de un gen de C. glutamicum; por sondeo del DNA genómico extraído de un cultivo de una población simple o mixta de microorganismos en condiciones severas con una sonda que abarca una región de un gen de C. glutamicum que es exclusivo de este organismo, puede averiguarse si dicho organismo está presente. Aunque Corynebacterium glutamicum no es patógeno en sí mismo, el mismo es afín a especies patógenas en humanos, tales como Corynebacterium diphtheriae (el agente causal de la difteria); la detección de tales organismos tiene una gran relevancia clínica.

La molécula de ácido nucleico MP de la invención puede servir también como punto de referencia para mapeado del genoma de C. glutamicum, o de genomas de organismos afines. Análogamente, esta molécula, o variantes o porciones de la misma, pueden servir como marcadores para especies de Corynebacterium o Brevibacterium modificadas por ingeniería genética.

La proteína MP codificada por la nueva molécula de ácido nucleico de la invención es capaz de, por ejemplo, realizar un paso enzimático implicado en el metabolismo de los aminoácidos, especialmente lisina y metionina. Dada la disponibilidad de vectores de clonación para uso en Corynebacterium glutamicum, tales como los descritos en Sinskey et al, patente U.S. No. 4.649.119, y técnicas para manipulación genética de C. glutamicum y las especies de Brevibacterium afines (v.g., lactofermentum) (Yoshihama et al, J. Bacteriol. 162: 591-597 (1985); Katsumata et al., J. Bacteriol. 159: 306-311 (1984); y Santamaria et al., J. Gen. Microbiol. 130: 2237-2246 (1984)); la molécula de ácido nucleico de la invención puede utilizarse en la ingeniería genética de este organismo para hacer de él un productor mejor o más eficiente de dichos aminoácidos.

Esta producción o eficiencia de producción mejorada de dicho producto químico puede ser debida a un efecto directo de la manipulación del gen de la invención, o puede ser debida a un efecto indirecto de dicha manipulación. Específicamente, las alteraciones en los caminos metabólicos de C. glutamicum para los aminoácidos, especialmente lisina y metionina, pueden tener un impacto directo sobre la producción global de uno o más de estos compuestos deseados a partir de este organismo. Por ejemplo, la optimización de la actividad de una proteína del camino biosintético de lisina o metionina o la disminución de la actividad de una proteína del camino de degradación de lisina o metionina puede dar como resultado un aumento en el rendimiento o la eficiencia de producción de lisina o metionina a partir de dicho organismo modificado por ingeniería genética. Las alteraciones en las proteínas implicadas en estos caminos metabólicos pueden tener también un impacto indirecto sobre la producción o la eficiencia de producción de un producto químico fino deseado. Por ejemplo, puede eliminarse una reacción que está en competición por un compuesto intermedio necesario para la producción de una molécula deseada, o puede optimizarse un camino necesario para la producción de un compuesto intermedio particular para un compuesto deseado. Adicionalmente, modulaciones en la biosíntesis o degradación de lisina o metionina pueden aumentar la capacidad global del microorganismo para crecer y dividirse rápidamente, aumentando así el número y/o las capacidades de producción del microorganismo en cultivo e incrementando con ello el rendimiento posible del producto químico fino deseado.

El ácido nucleico y la molécula de proteína de la invención, solos o en combinación con una o más moléculas de ácido nucleico y proteínas del mismo o diferente camino metabólico, pueden utilizarse para mejorar directamente la producción o la eficiencia de producción de dichos productos químicos finos a partir de Corynebacterium glutamicum (v.g., metionina o lisina). Utilizando métodos genéticos recombinantes bien conocidos en la técnica, pueden manipularse una o más de las enzimas biosintéticas o degradantes de la invención para aminoácidos, especialmente lisina y metionina, de tal modo que se module su función. Por ejemplo, una enzima biosintética puede mejorarse en eficiencia, o puede destruirse su región de control alostérica de tal modo que se evite la inhibición por realimentación de la producción del compuesto. Análogamente, una enzima degradante puede delecionarse o modificarse por sustitución, deleción, o adición de tal modo que su actividad degradante para el compuesto deseado se reduzca sin deterioro de la viabilidad de la célula. En cada caso, el rendimiento global o la velocidad de producción del producto químico fino deseado pueden incrementarse.

Es asimismo posible que tales alteraciones en la molécula de proteína y el nucleótido de la invención puedan mejorar la producción de otros productos químicos finos además de los aminoácidos, v.g., lisina y metionina, vitaminas, cofactores, nutrientes farmacéuticos,...

1. Un polipéptido aislado de Corynebacterium glutamicum, estando implicada dicha proteína en el metabolismo de metionina y lisina y comprendiendo la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2.

2. Un polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende adicionalmente secuencias de aminoácidos heterólogas.

3. Una molécula de ácido nucleico aislada de Corynebacterium glutamicum que codifica la proteína de la reivindicación 1.

4. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 3, en donde dicho ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 1 o un complemento de la misma.

5. Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 4.

6. El vector de la reivindicación 5, que comprende adicionalmente uno o más ácidos nucleicos que codifican proteínas implicadas en caminos metabólicos.

7. El vector de la reivindicación 6, en donde los ácidos nucleicos segundo y ulteriores se seleccionan de las secuencias de número impar enumeradas en la Tabla 1, con inclusión de cualquier molécula de ácido nucleico designada F.

8. El vector de una cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, que es un vector de expresión.

9. Una célula hospedadora transfectada con el vector de expresión de la reivindicación 8, en donde dicha célula es un microorganismo.

10. La célula hospedadora de la reivindicación 9, en donde la célula pertenece al género Corynebacterium o Brevibacterium.

11. La célula de la reivindicación 10, seleccionada del grupo constituido por

Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium herculis, Corynebacterium lilium, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium acetophilum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium fujiokense, Corynebacterium nitrilophilus, Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium butanicum, Brevibacterium divaricatum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium heali, Brevibacterium ketoglutamicum, Brevibacterium ketosoreductum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium linens, Brevibacterium paraffinolyticum, y las cepas expuestas en la Tabla 3.

12. La célula hospedadora de una cualquiera de las reivindicaciones 9, 10 ó 11, en donde la expresión de dicha molécula de ácido nucleico da como resultado la modulación de la producción de metionina y/o lisina.

13. Un método de producción de un polipéptido de la reivindicación 1, que comprende cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 9 en un medio de cultivo apropiado.

14. Un método de producción de un producto químico fino, que comprende cultivar una célula de la reivindicación 12.

15. Un método de la reivindicación 14, en donde dicha célula se cultiva en presencia de una fuente de azufre.

16. El método de la reivindicación 14, en donde dicho método comprende adicionalmente el paso de recuperar el producto químico fino de dicho cultivo.

17. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 14, 15 ó 16, en donde el producto químico fino es un aminoácido.

18. El método de la reivindicación 17, en donde el aminoácido es metionina o lisina.

19. Un método para producir un producto químico fino que comprende cultivar una célula cuyo DNA genómico ha sido alterado por la inclusión de una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 4.

20. El método de la reivindicación 19, en el cual el DNA genómico de la célula ha sido alterado ulteriormente por la inclusión de un ácido nucleico que codifica una proteína implicada en caminos metabólicos.

21. El método de la reivindicación 20, en el cual dicho ácido nucleico adicional se selecciona de las secuencias de número impar enumeradas en la Tabla 1, con la exclusión de cualquier molécula de ácido nucleico designada F.

22. El método de las reivindicaciones 19 ó 20, en el cual la molécula de ácido nucleico se selecciona del grupo constituido por los genes metC, metB, metA, metE, metH, hom, asd, lysC, lysC/ask, rxa00657, dapA, dapB, dapC, dapD/argD, dapE, dapF, LysA, ddh, lysE, lysG, lysR, hsk, ppc, pycA, accD, accA, accB, addD, genes gpdh o cualquier combinación de los genes arriba mencionados.