ESCALAS DE ÁCIDO NUCLEICO.

Una escala de ácido nucleico que comprende una pluralidad de fragmentos de ácido nucleico en la que la masa relativa de cada fragmento de dicha pluralidad es no mayor que 3 veces la masa relativa de cualquier otro fragmento de dicha pluralidad,

en la que: la masa relativa se define como la relación de la masa de cada fragmento en comparación con la masa total de todos los fragmentos; y la masa de un fragmento se define como el tamaño (número de pares de bases) de cada longitud del fragmento multiplicada por el número de copias del mismo fragmento

Un procedimiento común de analizar fragmentos de ácido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN) es por la separación en una matriz de gel de agarosa o poliacrilamida. Tales matrices proporcionan un medio en que se pueden analizar tales fragmentos de diferentes tamaños y formas. En presencia de una corriente eléctrica, los fragmentos de ácido 5 nucleico migrarán a través de dicha matriz de gel en la dirección del electrodo positivo. Debido a que pequeñas moléculas lineales migran más fácil y rápidamente a través de los poros de una matriz que las moléculas más grandes, la matriz actúa como un tamiz molecular, lo que separa los fragmentos de diferentes tamaños. Los fragmentos de ácido nucleico más grandes normalmente se someten a electroforesis en geles de agarosa de baja concentración, mientras que los fragmentos más pequeños se separan en geles de agarosa de mayor concentración 10 o en geles de poliacrilamida, debido a que la poliacrilamida tiene una mayor capacidad de resolución que la agarosa.

La detección de moléculas de ácido nucleico sometidas a electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida se puede lograr por una variedad de técnicas, que incluyen el uso de colorantes fluorescentes tales como bromuro de etidio y SYBR Green. Estos colorantes se unen a las moléculas de ácido nucleico y fluorescen cuando se exponen a 15 la luz ultravioleta (UV). En forma alternativa, las moléculas de ácido nucleico se pueden detectar por el acoplamiento químico de estas con marcas radioactivas, fluorescentes o quimioluminiscentes.

Los estándares de peso molecular de ácido nucleico son útiles para estimar la calidad, tamaño y/o cantidad de la muestra de ácido nucleico. Un estándar normalmente se fracciona en forma simultáneamente con la muestra (por 20 ejemplo, en paralelo con la muestra), y después de la detección, se hace una comparación entre las bandas de la muestra y las bandas del estándar. El conocimiento del tamaño (en pares de bases) del estándar permite estimar el tamaño del fragmento desconocido.

Los estándares comunes usados para estimar el tamaño de los fragmentos de ácido nucleico incluyen digestos de 25 restricción de moléculas de ácido nucleico tales como ADN genómico natural de los bacteriófagos (por ejemplo, bacteriófago lambda) que dan origen a una población de fragmentos de ácido nucleico de tamaño conocido. Estos tipos de estándares se llaman comúnmente "marcadores de ácido nucleico" (por ejemplo, "marcadores de ADN").

Otro tipo de estándar de ácido nucleico es producido por la manipulación genética de los plásmidos para contener 30 sitios de restricción/escisión para una o más endonucleasas de restricción específicas en intervalos particulares del plásmido. Después de la digestión del plásmido con las endonucleasas específicas, se generan fragmentos de ácido nucleico de tamaños conocidos específicos. Para la precisión de la determinación de tamaño y la facilidad de uso, es beneficioso tener numerosas bandas que aumentan de tamaño en intervalos uniformes y regulares. Estos tipos de estándares se llaman comúnmente "escalas de ácido nucleicos" (por ejemplo, "escalas de ADN"). Preferiblemente, 35 cada fragmento generado de la digestión forma una banda diferenciada y más preferiblemente las bandas del digesto son equivalentes o sustancialmente equivalentes en intensidad cuando se colorea para facilitar la detección de cada banda.

Ninguna de las escalas de ADN disponibles en el comercio proporciona un intervalo de tamaños de fragmento 40 estándar en el que bandas electroforéticas de alto peso molecular de 1 kilobase (kb) o mayores y bandas de peso molecular bajo de 1 kb o menores, especialmente bandas en el intervalo de 100-500 pb, se resuelven claramente y son iguales o sustancialmente iguales en intensidad de modo que son capaces de dar fragmentos de ácido nucleico de tamaño que abarca un amplio intervalo de peso molecular mediante el uso de un estándar de ácido nucleico.

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Una escala de ADN de 1 Kb está actualmente disponible en Life Technologies, Inc. (Rockville, Maryland). Esta escala contiene doce bandas en aumentos de 1018 pb, una banda de 1636 pb, una banda de 517 pb, y varias bandas de tamaño menor que varían en tamaño de 506 pb a 75 pb. Sin embargo, los fragmentos menores que 1 Kb parecen menos intensos y menos diferenciados que las bandas de incremento de 1018 pb. Asimismo, la banda de 1.636 pb y la banda doblete de 517/506 pb se colorean más intensamente que las otras bandas en la escala. 50

Otro producto disponible en el comercio es la "Escala de ADN de Kb", disponible en Stratagene (La Jolla, CA). Este producto contiene doce bandas de incrementos exactos de 1 Kb y tres bandas menores que 1 Kb. La intensidad de las bandas menores que 2 Kb es aproximadamente la mitad de las bandas de 2 Kb y más grandes. Además, las bandas de la escala mayores que 6 Kb se colorean con menos de intensidad que las bandas de 2 Kb - 6 Kb.

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La Promega Corporation (Madison, WI) vende una escala de ADN de 1 Kb con ocho bandas de incremento de 1 Kb que varían de 1 Kb a 10 Kb (no hay bandas de 7 o 9 Kb en esta escala) y tres bandas inferiores de 1 Kb. Las bandas de 1 Kb y 3 Kb en la Escala de ADN de 1 Kb disponible en Promega tienen aumento de intensidad (>2 veces) para servir como puntos de referencia dentro de la escala. Además de esto, las bandas de 8 Kb y 10 Kb son significativamente más intensas que otras bandas en la escala y las bandas de 0,25, 0,5, y 0,75 Kb son de varias 60 intensidades.

La escala de ADN de 1 Kb comercializada por Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) es prácticamente idéntica al producto Promega, excepto que solo contiene una banda inferior a 1 Kb (la banda de 0,5 Kb). Varias de las bandas en la escala de ADN de 1 Kb comercializada por Sigma varían en sus intensidades y esta escala contiene 65 solo una banda menor que 1 Kb.

Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ) comercializa un producto llamado "Marcador de ADN de Kilobase" que es probablemente el mismo producto descripto antes y comercializado por Sigma.

Una "Escala de ADN de 1 Kilobase" está comercializada por Bayou Biolabs (Harahan, LA) que tiene bandas con 5 incrementos de 1 Kb hasta 10 Kb. Este producto no contiene ninguna banda menor que 1 Kb. El producto de Bayou Biolabs tiene una banda de intensidad triple de 5 Kb y no contiene ninguna banda menor que 1 Kb.

Dos versiones disponibles en el comercio diferentes de una Escala de ADN de 1 Kb, comercializadas por GenSura (DelMar, CA) e Invitrogen (San Diego, CA) se consideran idénticas. Estas escalas tienen bandas de incremento de 1 10 Kb desde 1 Kb a 15 Kb y, como en el producto de Bayou Biolabs, no tiene bandas menores que 1 Kb y una banda de intensidad triple de 5 Kb.

En consecuencia, en vista de lo anterior, existe una necesidad de una escala de ADN que abarque un intervalo de longitud amplio y que, cuando se separe en un gel y se tiña, genere bandas diferenciadas que sean claras y visibles 15 y sean de intensidad igual relativa en comparación entre sí. Esto es específicamente significativo para las longitudes de banda menores que 1 Kb (en particular las de 500 pb y menores).

La presente invención proporciona una escala de ácido nucleico que comprende una pluralidad de fragmentos de ácido nucleico en que la masa relativa de cada fragmento de dicha pluralidad es no mayor que 3 veces la masa 20 relativa de cualquier otro fragmento de dicha pluralidad, en la que: la masa relativa se define como la relación de la masa de cada fragmento en comparación con la masa total de todos los fragmentos; y la masa de un fragmento se define como el tamaño (número de pares de bases) de cada longitud del fragmento multiplicado por el número de copias del mismo fragmento. La escala de ácido nucleico de la invención es útil para estimar el tamaño de fragmentos de ácido nucleico desconocidos, específicamente para estimar el tamaño (en pares de bases) de los 25 fragmentos de ácido nucleico que abarcan un intervalo amplio de tamaños de peso molecular. Las escalas de ácido nucleico de la invención incluyen ARN o ADN y pueden ser de cadena simple o doble, aunque se prefieren las escalas de ADN de cadena doble.

Preferiblemente, las... [Seguir leyendo]

1. Una escala de ácido nucleico que comprende una pluralidad de fragmentos de ácido nucleico en la que la masa relativa de cada fragmento de dicha pluralidad es no mayor que 3 veces la masa relativa de cualquier otro fragmento de dicha pluralidad, en la que: 5

la masa relativa se define como la relación de la masa de cada fragmento en comparación con la masa total de todos los fragmentos; y

la masa de un fragmento se define como el tamaño (número de pares de bases) de cada longitud del fragmento 10 multiplicada por el número de copias del mismo fragmento.

2. La escala de ácido nucleico de la reivindicación 1 que comprende dos o más fragmentos que varían de 25 Kb a 100 pb.

15

3. La escala de ácido nucleico de la reivindicación 2 que comprende dos o más fragmentos que varían de 20 Kb a 100 pb.

4. La escala de ácido nucleico de la reivindicación 3 que comprende dos o más fragmentos que varían de 15 Kb a 100 pb. 20

5. La escala de ácido nucleico de la reivindicación 4 que comprende dos o más fragmentos que varían de 12 Kb a 100 pb.

6. Una escala de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes en la que los 25 fragmentes difieren en longitud por x pares de bases en donde x es un número entero igual o mayor que 10.

7. Una escala de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6 en la que el número entero es igual o mayor que 100.

30

8. La escala de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en la que dicha escala está compuesta de fragmentos de ácido nucleico que tienen incrementos entre tamaños de fragmento de aproximadamente 1 kb y uno o más fragmentos de ácido nucleico menores que 1 Kb.

9. La escala de ácido nucleico de la reivindicación 8 en la que dichos fragmentos de ácido nucleico menores que 1 35 Kb están en incrementos de 10 pb, 20 pb, 30 pb, 40 pb, 50 pb, 60 pb, 70 pb, 80 pb, 90 pb o 100 pb.

10. La escala de ácido nucleico de la reivindicación 8 que comprende copias múltiples de uno o más fragmentos seleccionados del grupo que consiste en 100 pb, 500 pb, 50 pb, y 10 pb de longitud.

40

11. La escala de ácido nucleico de la reivindicación 1 que comprende 9 copias de una secuencia de 100 pb, 4 copias de una secuencia de 200 pb, 3 copias de una secuencia de 300 pb, 2 copias de una secuencia de 400 pb, 2 copias de una secuencia de 500 pb, y una copia de una secuencia de 650 pb, una de 850 pb, una de 1650 pb y un fragmento de 12 Kb que se digiere parcialmente para generar fragmentos que aumentan de tamaño en 1 Kb, el fragmento más grande es de 12 Kb. 45

12. La escala de ácido nucleico de cualquier reivindicación precedente en la que dicha escala comprende una marca detectable y en la que dicha marca detectable es bromuro de etidio.

13. La escala de ácido nucleico de cualquier reivindicación precedente en la que dicha marca detectable es SYBR 50 green.

14. La escala de ácido nucleico de cualquier reivindicación precedente en la que la escala está en un tampón de conservación que comprende un colorante.

55

15. La escala de ácido nucleico de la reivindicación 14 en la que dicho colorante se selecciona del grupo que consiste en azul de bromofenol, verde de xileno.

16. La escala de ácido nucleico de cualquier reivindicación precedente, en la que la masa relativa de cada fragmento de dicha pluralidad es no mayor que 2,5 veces la masa relativa de cualquier otro fragmento de dicha pluralidad. 60

17. La escala de ácido nucleico de la reivindicación 15, en la que la masa relativa de cada fragmento de dicha pluralidad es no mayor que 2 veces la masa relativa de de cualquier otro fragmento de dicha pluralidad.

18. La escala de ácido nucleico de la reivindicación 17, en la que la masa relativa de cada fragmento de dicha 65 pluralidad es no mayor que 1,5 veces la masa relativa de de cualquier otro fragmento de dicha pluralidad.

19. La escala de ácido nucleico de la reivindicación 18, en la que la masa relativa de cada fragmento de dicha pluralidad es aproximadamente la misma.

20. La escala de ácido nucleico de la reivindicación 19 en la que el número de copias de cada fragmento de dicha 5 pluralidad es tal que la masa relativa de cada fragmento es no mayor que 2,5 veces la masa de cualquier otro fragmento de dicha pluralidad.

21. La escala de ácido nucleico de la reivindicación 20 en la que el número de copias de cada fragmento de dicha pluralidad es tal que la masa relativa de cada fragmento es no mayor que 2 veces la masa de cualquier otro 10 fragmento de dicha pluralidad.

22. La escala de ácido nucleico de la reivindicación 21 en la que el número de copias de cada fragmento de dicha pluralidad es tal que la masa relativa de cada fragmento es no mayor que 1,5 veces la masa de cualquier otro fragmento de dicha pluralidad. 15