ENZIMAS MEJORADAS Y DETERGENTES QUE LAS CONTIENEN.

Una proteasa subtilisina mutante del Bacillus lentus DSM 5483,

caracterizada por lo menos por una alteración de aminoácido que se traduce en una menor carga positiva o una mayor carga negativa en la región de la bolsa de fijación al sustrato, dicha alteración de aminoácido es S154D o S154E en combinación con una alteración de aminoácido R99G, A, S o E con arreglo al recuento de la SEQ ID NO 22

Antecedentes de la invención

1. Ámbito de la invención Esta invención se refiere a nuevas enzimas proteolíticas mutantes de Bacillus lentus DSM 5483 que tienen propiedades mejoradas con respecto a la enzima de tipo salvaje en formulaciones detergentes y de limpieza, a secuencias de nucleótidos que codifican a las proteasas mejoradas y a los organismos hospedantes que contienen las secuencias de nucleótidos que codifican a las nuevas proteasas. Esta invención incluye también dentro de su alcance a nuevas composiciones mejoradas detergentes y de limpieza que contienen una cantidad limpiadora eficaz de dichas enzimas.

2. Descripción de la técnica anterior

Las subtilisinas son un grupo de proteasas bacterianas extracelulares que tienen pesos moleculares de 20.000 a

45.000 daltones y se producen por los bacilos de la suciedad, p.ej. el Bacillus amyloliquefaciens. Las proteasas son enzimas que catalizan la hidrólisis de enlaces peptídicos de las proteínas y sustratos peptídicos y de los enlaces 15 éster de algunos grupos éster terminales. Las subtilisinas pertenecen al grupo de las proteasas de serina, que inician el ataque nucleófilo al enlace peptídico (éster) por un resto serina del sitio activo. Las subtilisinas son enzimas física y químicamente bien caracterizadas. Se ha elucidado con detalle la estructura tridimensional de diversas subtilisinas por estudios de difracción de rayos X (Betzel, C., Pal, G.P. y Saenger, W., Eur. J. Biochem. 178, 155171, 1988; Bott, R., Ultsch, M., Kossiakoff, A., Graycar, T., Katz, B. y Power, S., J. Biol. Chem. 263, 7895-7906, 20 1988; Goddette, D.W., Paech, C., Yang, S.S., Mielenz, J.R., Bystroff, C., Wilke, M. y Fletterick, R.J., J. Mol. Biol. 228, 580-595, 1992; Heinz, D.W., Priestle, J.P., Rahuel, J., Wilson, K.S. y Grütter, M.G., J. Mol. Biol. 217, 353-371, 1991; Kraut, J., Annu. Rev. Biochem. 46, 331-358, 1977; Neidhart, D.J. y Petsko, G.A., Protein Eng. 2, 271-276, 1988; Teplyakov, AV., Kuranova, I.P., Harutyunyan, E.H., Vainshtein, B.K, Frömmel, C., Höhne, W. E. y Wilson, K.S., J. Mol. Biol. 214, 261-279, 1990). A pesar de este cúmulo de información no se han explicado las diferencias de estructura/función entre estas subtilisinas muy afines.

Las subtilisinas se emplean ampliamente en productos comerciales (por ejemplo, en detergentes de lavandería y de lavavajillas, productos de limpieza de lentes de contacto) y con fines de investigación (catalizadores de química orgánica sintética). Un componente del grupo de las subtilisinas, una proteasa muy alcalina para el uso en formulaciones detergentes se ha descrito en la solicitud de patente WO 91/02792. Esta proteasa alcalina de Bacillus lentus 30 (BLAP) se obtiene en cantidades industriales de la cepa del Bacillus licheniformis ATCC 53926 transformada por un plásmido de expresión que alberga el gen de la BLAP de tipo salvaje bajo el control del promotor del gen de la proteasa alcalina del B. licheniformis ATCC 53926. Se ha deducido la estructura cristalina de la BLAP (Goddette,

D.W. y col., J. Mol. Biol. 228, 580-595, 1992; WO 92/21760) y se han depositado las coordenadas en el banco de datos llamado Brookhaven Protein Data Bank. A menos que se indique otra cosa, la numeración de las posiciones de los aminoácidos se realiza con arreglo a la secuencia de la BLAP (269 aminoácidos), que difiere de la subtilisina BPN' (275 aminoácidos). Si se alinean para obtener una homología óptima de secuencia surge el siguiente modelo. Las posiciones de 1 a 35, de 36 a 54, de 55 a 160 y de 161 a 269 de la BLAP corresponden a las posiciones de 1 a 35, de 37 a 55, de 57 a 162 y de 167 a 275, respectivamente, de la subtilisina BPN'.

Con el fin de describirlas variantes de la proteasa del Bacillus lentus DSM 5483 según la invención, se empleará la

40 nomenclatura siguiente: [aminoácido original; posición desde el extremo N de la enzima madura; aminoácido sustituido]. Por ejemplo, la sustitución de la valina con isoleucina en la posición 4 de la BLAP se denomina V4I. La lista de abreviaturas de aminoácidos se recoge en la tabla 1.

Tabla

Nomenclatura de aminoácidos

45 A = Ala = alanina C = Cys = cisteína D = Asp = ácido aspártico E = Glu = ácido glutámico F = Phe = fenilalanina

50 G = Guy = glicina H = His = histidina I = Ile = isoleucina K = Lys = lisina L = Leu = leucina M = Met = metionina N = Asn = asparagina P = Pro = prolina Q = Gin = glutamina R = Arg = arginina S = Ser = serina T = Thr = treonina V = Val = valina W = Trp = triptófano Y = Tyr = tirosina

Las mutaciones múltiples dentro de una misma molécula de proteína se indican como suma de las mutaciones individuales, por ejemplo S3T + V4I + A188P + V193M + V199I.

La protección contra la inactivación térmica y química y la mejora de la potencia de lavado y limpieza son los objetivos primarios de la investigación y el desarrollo de proteasas para aplicaciones técnicas e industriales. Se ha generado un gran número de enzimas, incluidas las subtilisinas, por mutagénesis aleatoria y específica de sitio, que proporcionan algunas directrices de enfoque racional de la mejora de la estabilidad térmica y química (Estell, D.A., Graycar, T.P. y Wells, J.A., J. Biol. Chem. 260, 6518-6521, 1985; Matsumura, M., Becktel, W.J., Levitt, M. y Matthews, B.W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6562-6566, 1989; Pantoliano, M.W., Whitlow, M., Wood, J.F., Rollence, M.L., Finzel, B.C., Gillily, G.L., Poulos, T.L. y Bryan, P.N., Bioquimica 27, 8311-8317, 1988; Russell, A.J. y Fersht, A.R., Nature 328, 496-500, 1987; Siezen, R.J., De Vos, W.M., Leunissen, J.A.M. y Dijkstra, B.W., Protein Eng. 4, 719-737, 1991; van Ee, J.H., Chimicaoggi (7/8), 31-35, 1991; Wells, J.A. y Estell, D.A., Trends Biochem. Sci. 13, 291-297, 1988). La modulación de actividad enzimática, en particular la intensificación u optimización de eficacia de un subgrupo de sustratos es un problema mucho más complejos. En la EP 0260105 se describe la construcción de mutantes de subtilisina BPN' con velocidades alteradas de transesterificación/hidrólisis y con especificidades nucleófilas alteradas cambiando los restos aminoácido específicos dentro de 15 Å de la tríada catalítica. Russell, A.J. y Fersht, A.R., J. Mol. Biol. 193, 803-813, 1987, describen el aislamiento de un mutante de subtilisina BPN' (D099S)que presenta un cambio de carga superficial de 14 a 15Å del sitio activo. Esta sustitución provoca un efecto en la dependencia del pH de la reacción catalítica de la subtilisina. Pero estas publicaciones no indican el modo de predecir las alteraciones de aminoácidos que mejorarán la eficacia de lavado de la proteasa. En los documentos EP 0130756, EP 0247647 y US 4,760,025 se describe un método de mutación de saturación, en el que se introducen una o múltiples mutaciones en la subtilisina BPN' en los restos aminoácidos (numeración de la BPN') Asp32, Asn155, Tyr104, Met222, Gly166, His64, Ser221, Gly169, Glu156, Ser33, Phe189, Tyr217 y/o Ala152. Aplicando esta estrategia se obtienen proteasas mutantes que poseen una mejor estabilidad a la oxidación, una especificidad alterada de sustrato y/o una actividad alterada de pH. En estas publicaciones se describe también que las mutaciones dentro de la región de sitio activo de la proteasa son las idóneas para influir en la actividad. Sin embargo, ni en la EP 0130756, EP 0247647 ni en la US 4,760,025 se describe un método para predecir las alteraciones de aminoácidos que mejorarán la eficacia de lavado de la proteasa.

La mayor parte de la información de la actividad catalítica de las subtilisinas se ha recogido examinando la hidrólisis de sustratos peptídicos pequeños y bien definidos. Pero se sabe muy poco de las interacciones con sustratos proteicos grandes. Lo dicho se cumple en especial respecto a la eficacia de lavado de proteasas cuando el sustrato está fijado sobre una superficie textil y la catálisis tiene lugar en presencia de compuestos interferentes, como son los agentes de blanqueo, tensioactivos y sustancias soporte (builders).

En la EP 0328229 se describe el aislamiento y la caracterización de las mutantes de subtilisina PB92 que tienen propiedades mejoradas para aplicaciones detergentes en lavandería, basadas en los resultados de los ensayos de lavado. En ella se describe que las propiedades bioquímicas no son parámetros fiables para predecir la eficacia de lavado que tiene la enzima. Los métodos para seleccionar mutaciones incluyen la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido de la misma categoría (polar, no polar, aromático, cargado, alifático y neutro), la... [Seguir leyendo]

1. Una proteasa subtilisina mutante del Bacillus lentus DSM 5483, caracterizada por lo menos por una alteración de aminoácido que se traduce en una menor carga positiva o una mayor carga negativa en la región de la bolsa de fijación al sustrato, dicha alteración de aminoácido es S154D o S154E en combinación con una alteración de aminoácido R99G, A, S o E con arreglo al recuento de la SEQ ID NO 22.

2. Proteasa mutante según la reivindicación 1, derivada de la proteasa descrita en la SEQ ID NO 22 por la siguiente alteración de aminoácido: S154D o S154E en combinación con una alteración de aminoácido R99G, A, S o E.

3. Un gen mutante que codifica a la proteasa alcalina mutante del Bacillus lentus DSM 5483 (BLAP) que, en la dirección de la transcripción, contiene un promotor, un sitio de fijación ribosómico, un codón de inicio, la porción principal de la región “pre” del gen de la proteasa alcalina del Bacillus licheniformis ATCC 53926 unida operativamente a una porción de la región “pre” y a todas las de las regiones “pro” y maduras del gen que codifica a la variante M131 de la BLAP, seguidos por el terminador de la transcripción de la proteasa alcalina del ATCC 53926, dichos codones de dicho gen de la BLAP se han alterado para producir un gen mutante que codifica a la proteasa alcalina mutante del Bacillus lentus DSM 5483 M131 que tiene por lo menos una alteración de aminoácido que se traduce en una disminución de la carga positiva o en un aumento de la carga negativa en la región de la bolsa de fijación al sustrato, dicho alteración de aminoácido es S154D o S154E en combinación con una alteración de aminoácido R99G, A o S, con arreglo al recuento de la SEQ ID NO 22.

4. Un plásmido capaz de replicación en especies del género bacilo, dicho plásmido lleva un gen de proteasa mutante según la reivindicación 3.

5. Un hospedante transformado del género bacilo, que contiene un plásmido según la reivindicación 4.

6. Una célula hospedante transformada de bacilo según la reivindicación 5, dicha célula hospedante es el Bacillus licheniformis ATCC 53926.

7. Una célula hospedante transformada de bacilo según la reivindicación 5, dicha célula hospedante es el Bacillus subtilis.

8. Composición detergente que contiene por lo menos un tensioactivo y una proteasa subtilisina mutada según una de las reivindicaciones 1 y 2.

9. Una composición detergente según la reivindicación 8 que contiene una cantidad proteolíticamente activa de dicha proteasa mutada, dicha proteasa tiene una relación de actividad queratinasa/caseinasa (proporción KC) inferior a 0,80, con preferencia inferior a 0,70, con mayor preferencia entre 0,2 y 0,65.

10. Una composición detergente según la reivindicación 9 para el lavado de tejidos compuestos por fibras proteinogénicas.

11. Una composición detergente según una de las reivindicaciones de 8 a 10, en la que dicha proteasa tiene una actividad proteolítica de 100 PU/g a 7500 PU/g.

12. Una composición detergente según una de las reivindicaciones de 8 a 11, en la que dicho por lo menos un tensioactivo contiene un tensioactivo no iónico elegido entre el grupo formado por un poliglucósido alquil-graso, un polialcoxilato alquil-graso, una polihidroxiamida de ácidos grasos, una alquilamina grasa etoxilada, una alquilamina grasa propoxilada, un diol vecinal etoxilado, un diol vecinal propoxilado, un éster de alquilo de ácido graso etoxilado, un éster de alquilo de ácido graso propoxilado, una amida de ácido graso etoxilado, una amida de ácido graso propoxilado y mezclas de los mismos.

13. Una composición detergente según la reivindicación 12, en la que dicho tensioactivo no iónico está presente en una cantidad del 2% al 25% en peso.

14. Una composición detergente según la reivindicación 12 ó 13, que contiene además un tensioactivo aniónico, elegido entre el grupo formado por: un sulfato de alquil-graso, un éter-sulfato de alquil-graso, un éster de ácido sulfo-graso, una disal de ácido sulfo-graso y combinaciones de los mismos.

15. Una composición detergente según una de las reivindicaciones de 8 a 11, en la que dicho por lo menos un tensioactivo contiene un tensioactivo aniónico elegido entre el grupo formado por un sulfato de alquil-graso, un éter-sulfato de alquil-graso, un éster de ácido sulfo-graso, una disal de ácido sulfo-graso y combinaciones de los mismos.

16. Una composición detergente según la reivindicación 14 ó 15, en la que dicho tensioactivo aniónico está presente en una cantidad del 2% al 25% en peso.

17. Una composición detergente según una de las reivindicaciones de 14 a 16, en la que dicho tensioactivo aniónico se elige entre el grupo formado por un sulfato de alquilo, un sulfato de alquenilo, un éter-sulfato de alquilo, un éter-sulfato de alquenilo, dichos grupos alquilo o alquenilo contienen de 8 a 22 átomos de carbono, con preferencia de 12 a 18 átomos de carbono.

18. Una composición detergente según una de las reivindicaciones de 8 a 17, que contiene además una sustancia soporte (builder) elegida entre el grupo formado por un alumosilicato de metal alcalino, un silicato cristalino de metal alcalino con un módulo superior a 1, un policarboxilato monomérico, un policarboxilato polimérico y mezclas de los mismos.

5 19. Una composición detergente según la reivindicación 18, en la que dicha sustancia soporte está presente en una cantidad del 2,5% al 60% en peso.

20. Una composición detergente según una de las reivindicaciones de 8 a 19 que contiene además del 20% al 55% en peso de una sustancia soporte inorgánica; hasta el 15% en peso de una sustancia soporte orgánica soluble en agua; del 2,5% al 20% en peso de un tensioactivo aniónico; del 1% al 20% en peso de un tensioactivo no iónico; hasta el 25% en peso de un agente blanqueante; hasta el 8% en peso de un activador de blanqueo; hasta el 20% en peso de una sal inorgánica; del 0,4% al 1,2% en peso de lipasas, cutinasas, amilasas, celulasas, pululanasas, oxidasas o peroxidasas.

21. Una composición detergente según la reivindicación 20, en la que dicha sal inorgánica es un carbonato de metal alcalino, un hidrogenocarbonato de metal alcalino o un sulfato de metal alcalino.

15 22. Un método para lavar materiales textiles, que consiste en poner en contacto dichos materiales textiles con una composición detergente según una de las reivindicaciones de 8 a 21.

23. Un método para lavar materiales textiles según la reivindicación 22, en el que dichos materiales textiles están compuestos por fibras proteinogénicas.

24. Un método según las reivindicaciones 22 ó 23 para eliminar las manchas de la ropa que tenga manchas no solo 20 de sangre sino también de huevo.