Una proteína de unión a fosfato que experimenta un cambio conformacional desde una conformación inicial a una conformación final después de la unión al fosfato,

en la que la proteína porta una primera marca y una segunda marca que pueden exhibir apilamiento molecular y en la que el apilamiento molecular se altera al cambiar de una conformación a la otra

Todos los documentos mencionados en la presente memoria se incorporan por referencia en su totalidad.

Campo técnico

La presente invención se refiere a ensayos para fosfato inorgánico, en particular la detección y cuantificación de fosfato inorgánico en soluciones biológicas. Más particularmente, la presente invención se refiere a una proteína de unión a fosfato modificada, y al uso de tal proteína en un ensayo de fosfato.

Antecedentes de la técnica

El fosfato inorgánico (Pi) está involucrado en una gran cantidad de procesos biológicos y es conveniente poder medir la concentración de Pi y los cambios de tal concentración en los sistemas biológicos. Los ensayos de fosfato, que miden la concentración de Pi, son útiles en numerosos procedimientos diagnósticos, así como en la investigación en el funcionamiento de los sistemas biológicos.

Los ensayos de fosfato enzimático se basan en una enzima que requiere fosfato, a menudo una fosforilasa. La referencia 1 describe un procedimiento en el cual se usa una purina-nucleósido fosforilasa para convertir un nucleósido (inosina) a ribosa-1-fosfato y una base, en este caso, hipoxantina. La hipoxantina se convierte posteriormente en un agente de color, de la cual se puede determinar el grado de conversión a inosina, que es dependiente de la concentración de Pi.

Los ensayos de fosfato enzimático tienden a ser relativamente insensibles. Por ejemplo, la referencia 2 describe un procedimiento que no se puede usar por debajo de las concentraciones de Pi de 2 µM. Además, aunque más rápidos que los ensayos químicos de fosfatos, los ensayos enzimáticos de fosfato son generalmente demasiado lentos para permitir el estudio de la cinética de muchos sistemas biológicos en tiempo real.

Un número de sistemas de ensayo de fosfato es conocido en la técnica. Por ejemplo, los kits de Detección de Fosfato con Verde de Malaquita (MGPD) son útiles para detección cuantitativa de Pi. El kit de ensayo de fosfato Quantichrom (BioAssay Systems) es uno de dichos kit MGPD. Sin embargo, el ensayo usado es muy lento y requiere la incubación para obtener el desarrollo de color. Además, los kits MGPD generalmente son útiles solo en concentraciones altas de fosfato (aproximadamente 0,3 mM – 50 mM).

El kit de ensayo de fosfato EnzChek de Invitrogen (Molecular Probes) tiene un intervalo de detección de la concentración de fosfato de 2 µM – 150 µM y un intervalo de pH de trabajo de 6,5 -8,5 (tomado de la hoja de datos). Nuevamente, esta prueba es inadecuada para la detección de concentración de fosfato baja.

Se conoce un número de proteínas que se unen específicamente al Pi. Por ejemplo, el transporte de Pi dentro y fuera de las células y organelas se realiza con proteínas de transporte específicas. En las células bacterianas, esto se logra por medio de un sistema de transporte de afinidad alta dependiente de una proteína de unión a fosfato. Tales proteínas son capaces de reconocer específicamente el fosfato inorgánico, se unen a este y lo transportan a través de las membranas celulares o entre los compartimientos celulares.

Un ejemplo de tal proteína es la proteína de unión a fosfato (PBP) de E. coli que está codificada por el gen phoS de

E. coli. Esta proteína se localiza en el periplasma de E. coli como parte del sistema de depuración de Pi de la bacteria, que opera en condiciones de privación de Pi, y su afinidad de unión por Pi es muy alta. El gen de phoS se ha clonado y secuenciado [3,4]. Más aún, se ha determinado que PBP se une estrechamente al Pi, y la estructura cristalina de la forma unida a Pi se ha resuelto con alta resolución [5], ya que tiene la estructura de la forma libre de Pi [6]. Estos estudios han demostrado que PBP es una proteína monomérica de 35 kD separada en dos dominios, con una hendidura de unión a Pi entre ellos. La hendidura de unión a Pi se mueve entre las posiciones abierta y cerrada en la unión al Pi.

La referencia 7 describe la modificación de la PBP para introducir una marca de cumarina en el borde de la hendidura de unión al Pi. El cambio conformacional en la hendidura de unión que ocurre después de la unión al fosfato se traduce en un aumento de la fluorescencia de la marca de cumarina. Sin embargo, la universalidad del fosfato en los sistemas biológicos y el deseo de controlar la cinética de procesos biológicos y químicos que involucran el consumo o producción de Pi hace que el desarrollo de ensayos de fosfato adicionales y mejorados sea importante.

Divulgación de la invención

La invención se basa en el descubrimiento de que, por la unión de marcas múltiples a la PBP, se pueden obtener mejoras en los cambios detectables que ocurren después la unión del Pi. Los fluoróforos tales como rodaminas se pueden apilar, sea con ellos mismo (en tal caso el apilamiento se denomina como dimerización) o con otra molécula aromática, para formar un complejo con diferentes propiedades ópticas de las de las moléculas no apiladas. Se ha hallado que la unión de Pi a la PBP puede producir cambios en el apilamiento de cromóforos ubicados apropiadamente, de este modo producen un cambio detectable. Más aún, se ha hallado de modo sorprendente que las marcas unidas a las regiones de la PBP que están distantes de la hendidura de unión a Pi aun pueden dar cambios detectables cuando el Pi se une a la proteína, de este modo permiten que las marcas se fijen con mínima interferencia a la unión a Pi.

En consecuencia la invención proporciona una proteína de unión a fosfato que experimenta un cambio conformacional desde una conformación inicial a una conformación final después de la unión del fosfato, en la que la proteína porta una primera marca y una segunda marca, y en la que la primera y segunda marcas se disponen de modo de exhibir apilamiento molecular. Este apilamiento se altera con el cambio de conformación en la unión al Pi. La alteración del apilamiento origina un cambio detectable, que indica un cambio en el estado de la unión a Pi.

Preferentemente el cambio es tal que la primera y segunda marcas pueden presentar apilamiento molecular (a) en la conformación inicial pero no en la conformación final, o (b) en la conformación final pero no en la conformación inicial.

El uso de dos marcas contrasta con la referencia 28, que describe específicamente que se debe evitar la marcación de múltiples sitios cuando se fijan los fluoróforos a las PBP. La referencia 25 también se refiere a que la marcación doble lleva a una disminución de la señal cuando se usa un fluoróforo solo.

La invención también proporciona una proteína de unión a fosfato que experimenta un cambio conformacional desde una conformación inicial a una conformación final después de la unión del fosfato, en la que la unión del fosfato ocurre en un sitio de unión, y en que la proteína porta una marca que se fija a una región de la proteína distante del sitio de unión. La marca puede dar una primera señal detectable en la conformación inicial y una segunda señal detectable en la conformación final, en la que dicha primera y segunda señales detectables son diferentes entre sí.

La invención también proporciona una proteína de unión a fosfato que experimenta un cambio conformacional desde una conformación inicial a una conformación final después de la unión del fosfato, en el que la proteína porta una marca de rodamina. La marca de rodamina puede dar una primera señal detectable en la conformación inicial y una segunda señal detectable en la conformación final, en la que dichas primera y segunda señales detectables son diferentes entre sí.

La invención también proporciona una proteína de unión a fosfato que experimenta un cambio conformacional desde una conformación inicial a una conformación final después de la unión del fosfato, en la que la proteína porta una o más marcas, y en la que la/las marca(s) está/están fijadas por medio de un centro no quiral.

En comparación con las PBS marcadas con cumarina de la referencia 7, las PBP de la invención muestran una capacidad de unión evidente para Pi. En particular, ellas muestran un cambio de señal lineal hasta la máxima capacidad de unión para el Pi.

La proteína de unión a fosfato (PBP)

La invención utiliza una ‘proteína de unión a fosfato', que es el nombre comúnmente dado al receptor de fosfato primario del sistema de transporte de ABC hallado en las bacterias, también conocido como... [Seguir leyendo]

1. Una proteína de unión a fosfato que experimenta un cambio conformacional desde una conformación inicial a una conformación final después de la unión al fosfato, en la que la proteína porta una primera marca y una segunda marca que pueden exhibir apilamiento molecular y en la que el apilamiento molecular se altera al cambiar de una conformación a la otra.

2. La proteína de la reivindicación 1, en la que la primera y segunda marcas pueden exhibir apilamiento molecular

(a) en la conformación inicial pero no en la conformación final, o (b) en la conformación final pero no en la conformación inicial.

3. La proteína de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en la que la proteína de unión a fosfato es una proteína PhoS de E. coli.

4. La proteína de la reivindicación 3, en la que la proteína PhoS incluye dos sustituciones de cisteína, para la unión de la primera y la segunda marcas.

5. La proteína de la reivindicación 4 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO 3 y SEQ ID NO 4.

6. La proteína de cualquier reivindicación precedente, en la que la primera y segunda marcas incluyen fluoróforos.

7. La proteína de la reivindicación 6, en la que la primera y segunda marcas incluyen un grupo xanteno.

8. La proteína de la reivindicación 7, en la que la primera y segunda marcas incluye una rodamina.

9. La proteína de cualquier reivindicación precedente, en la que la primera y segunda marcas incluyen fluoróforos unidos a la proteína por medio de ligadores de haloacetamida.

10. La proteína de la reivindicación 9, en la que la rodamina es 6 IATR.

11. La proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que la primera y segunda marcas pueden apilarse en la conformación inicial.

12. La proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que la primera y segunda marcas pueden apilarse en la conformación final.

13. Un procedimiento para detectar fosfato inorgánico en una muestra, que comprende las etapas de: (i) mezclar la muestra con la proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, y (ii) detectar un cambio en la mezcla que surge de la interacción entre el fosfato inorgánico y la PBP. El cambio detectado en la etapa (ii) se puede relacionar con la concentración del fosfato inorgánico en la muestra.

14. Un kit que comprende una proteína de cualquier reivindicación precedente, y un limpiador de fosfato.