ENSAYO IN VITRO PARA MEDIR LA INMUNOGENIA DE UNA VACUNA.

Un ensayo para medir la inmunogenia de una vacuna, en el que la vacuna comprende un epítopo que tiene una conformación asociada a una forma inmunogénicamente activa de la vacuna y un fragmento que tiene una conformación asociada a una forma inmunogénicamente inactiva de la vacuna,

en el que el método comprende exponer a una muestra de la vacuna a un primer anticuerpo monoclonal capaz de unirse al epítopo en la conformación asociada a la forma inmunogénicamente activa de la vacuna y a un segundo anticuerpo monoclonal capaz de unirse al fragmento en la conformación asociada a la forma inmunogénicamente inactiva de la vacuna y medir la cantidad de primer anticuerpo monoclonal unido a la muestra de vacuna y la cantidad del segundo anticuerpo monoclonal unido a la muestra de vacuna

Referencia cruzada a la solicitud relacionada

Esta solicitud reivindica prioridad de la Solicitud Provisional de Estados Unidos Nº de Serie 60/233.439, presentada el 18 de septiembre de 2000, cuya totalidad se incorpora en este documento como referencia. 5

Antecedentes de la invención

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la medición in vitro de la inmunogenia de vacunas. En particular, la invención se refiere a la medición de la inmunogenia de vacunas en base a las propiedades de unión de formas inmunógenas y no inmunógenas de vacunas en base a partículas similares a virus. 10

Sumario de la técnica relacionada

Uno de los factores críticos en la determinación de la estabilidad de los productos de vacuna a granel y en viales es la medición de la inmunogenia. Por ejemplo, el ensayo de la potencia de partículas similares a un virus (VLP) de HPV-16 mediante la inmunización de ratones es una tarea que requiere mucho esfuerzo y tiempo. Típicamente, después de la inmunización del material de VLP formulado en ratones a diversos niveles de dosis, se requieren 15 aproximadamente seis semanas antes de que pueda determinarse si los animales son capaces de montar una respuesta inmune suficiente. Este problema se vuelve aún más difícil cuando se ensayan diversos adyuvantes y excipientes, debido al número de animales que deben utilizarse. En un esfuerzo por hacer más eficaces los esfuerzos de desarrollo es deseable encontrar un ensayo rápido y fiable que permita la evaluación de la inmunogenia de vacunas basadas en partículas similares a virus (VLP). 20

El documento de Ghim, SJ. et al., “Antigenicity of bovine papillomavirus type 1 (BPV-1) L1 virus-like particles compared that of intact BPV-1 virions” J. Gen. Virol., 77: 183 - 188, 1996 compara la antigenicidad de viriones de PV bovino de tipo 1 intacto (BPV-1) con el de VLP L1 de BPV recombinante mediante ELISA usando un panel bien caracterizado de anticuerpos policlonales y monoclonales generados contra partículas de BPV-1 intacto y desnaturalizado. 25

El documento White, W.I. et al., “Characterization of a major neutralizing epitope on human papillomavirus type 16 L1” J. Virol., 73 (6): 4882 - 4889, 1999 describe la unión de tres anticuerpos monoclonales a partículas similares a virus con L1 del virus del papiloma humano de tipo 16 compuestas por la secuencia de referencia L1 y tres secuencias variantes de L1.

Sumario y objetos de la invención 30

Es un objeto de la invención proporcionar un ensayo para medir la inmunogenia de una vacuna, en el que la vacuna comprende un epítopo que tiene una conformación asociada a una forma inmunogénicamente activa de la vacuna y un fragmento que tiene una conformación asociada a una forma inmunogénicamente inactiva de la vacuna. El método comprende exponer a una muestra de la vacuna a un primer anticuerpo monoclonal capaz de unirse al epítopo en la conformación asociada a la forma inmunogénicamente activa de la vacuna y un segundo anticuerpo monoclonal 35 capaz de unirse al fragmento en la conformación asociada a la forma inmunogénicamente inactiva de la vacuna y medir la cantidad de primer anticuerpo monoclonal unido a la muestra de vacuna y la cantidad del segundo anticuerpo monoclonal unido a la muestra de vacuna. Preferentemente, el primer y segundo anticuerpos monoclonales están marcados cada uno con una primera y segunda sustancias detectables, respectivamente, antes de la exposición de la vacuna a ellos, y en los que la cantidad de primer anticuerpo monoclonal unido a la forma inmunogénicamente activa de 40 la vacuna y de segundo anticuerpo monoclonal unido a la forma inmunogénicamente inactiva de la vacuna se determinan midiendo la cantidad de primera y segunda sustancias detectables asociadas a la muestra de vacuna después de la exposición al primer y segundo anticuerpos monoclonales. De la forma más preferente, la primera y segunda sustancias detectables emiten luz fluorescente de diferentes longitudes de onda cuando están unidas a la forma inmunogénicamente activa de la vacuna y a la forma inmunogénicamente inactiva de la vacuna, respectivamente, 45 y en el que la medición de la cantidad de primer y segundo anticuerpos monoclonales unidos a la vacuna se realiza midiendo la luz fluorescente emitida por la primera y segunda sustancias detectables. Típicamente, la muestra de vacuna comprende material de vacuna y un adyuvante.

En una realización preferida, la muestra de vacuna se coloca en una placa filtrante antes de la exposición al primer y segundo anticuerpos monoclonales. La placa filtrante comprende dos o más pocillos, en los que la muestra de 50 vacuna se coloca en al menos un pocillo y adyuvante de control desprovisto de material de vacuna se coloca en al menos otro pocillo que no contiene el material de vacuna, y en los que los primer y segundo anticuerpos monoclonales marcados se añaden a los pocillos en la placa. Los pocillos que contienen la muestra de vacuna se lavan después de la adición del primer y segundo anticuerpos monoclonales para retirar de los pocillos que contienen la muestra de vacuna el anticuerpo monoclonal en exceso que no está unido al material de vacuna antes de medir la luz emitida por las 55 sustancias fluorescentes.

La presente invención es particularmente adecuada para su implementación en ensayos de inmunogenia dirigidos a vacuna del virus del papiloma, particularmente vacuna del virus del papiloma basadas en partículas similares a virus que comprenden la proteína L1, más particularmente HPV-16 y HPV-18.

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Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra datos del ensayo en placa filtrante de J4 que muestra el efecto del tratamiento con timerosal sobre los patrones de unión a anticuerpo monoclonal J4, R5 y 18A1. Las barras de error representan el error estándar de triplicados ensayados en el ensayo.

La figura 2 muestra datos del ensayo de J4 después de 10 días de tratamiento con timerosal a 37ºC que muestran 5 la dramática pérdida de unión al anticuerpo J4 en muestras tratadas con timerosal. Las barras de error representan el error estándar de triplicados realizados en el ensayo.

La figura 3 muestra resultados del ensayo en placa filtrante de J4 que ensaya MEDI-517 (lote L98H074) que no superó el ensayo de inmunogenia en el punto temporal de estabilidad acelerada de 8 meses. Dado que no se conservó material de control del mismo lote, se preparó un lote adicional de material a la misma concentración de 10 HPV-18 y se usó como control. Las barras de error representan el error estándar de triplicados realizados en el ensayo de J4.

La figura 4 muestra el efecto del organomercurial específico de tiol ácido p-cloromercurifenilsulfónico (PCMPS) sobre el epítopo de J4 del material de HPV-18 según se ensayó en el ensayo en placa filtrante de J4. Las barras de error representan el error estándar de triplicados realizados en el ensayo de J4. 15

La figura 5 muestra el efecto del tratamiento con timerosal durante una noche sobre el epítopo de J4 a la elevada temperatura de 40ºC. La pérdida del epítopo de J4 se aceleraba en gran medida por encima del estado de almacenamiento a 37ºC, que requería casi 10 días para alcanzar el mismo nivel de pérdida. Las barras de error representan el error estándar de triplicados realizados en el ensayo de J4.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas 20

La presente invención se basa en el descubrimiento de que la combinación de unión a Mab de epítopo conformacional y lineal puede ayudar a determinar el estado relativo de desnaturalización de una muestra de vacuna. La invención se basa además en el descubrimiento de la correlación de la unión al epítopo conformacional con inmunogenia y neutralización. En base a estos descubrimientos, se cree que los datos correlativos obtenidos junto con el desarrollo de la presente invención permitirán una ruta alternativa para inmunogenia de vacunas que eliminen o 25 reduzcan drásticamente la necesidad de ensayos en animales de inmunogenia asociados con métodos convencionales de desarrollo de vacunas y control de calidad.

El concepto inventivo de la presente solicitud es particularmente adecuado para su implementación usando anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a un epítopo u otro fragmento de material de vacuna en diversos estados conformacionales que están directamente correlacionados con la actividad... [Seguir leyendo]

1. Un ensayo para medir la inmunogenia de una vacuna, en el que la vacuna comprende un epítopo que tiene una conformación asociada a una forma inmunogénicamente activa de la vacuna y un fragmento que tiene una conformación asociada a una forma inmunogénicamente inactiva de la vacuna, en el que el método comprende exponer a una muestra de la vacuna a un primer anticuerpo monoclonal capaz de unirse al epítopo en la conformación asociada 5 a la forma inmunogénicamente activa de la vacuna y a un segundo anticuerpo monoclonal capaz de unirse al fragmento en la conformación asociada a la forma inmunogénicamente inactiva de la vacuna y medir la cantidad de primer anticuerpo monoclonal unido a la muestra de vacuna y la cantidad del segundo anticuerpo monoclonal unido a la muestra de vacuna.

2. El ensayo de la reivindicación 1, en el que los primer y segundo anticuerpos monoclonales están, cada uno, 10 marcados con una primera y segunda sustancias detectables, respectivamente, antes de la exposición de la vacuna a ellos, y en el que la cantidad de primer anticuerpo monoclonal unido a la forma inmunogénicamente activa de la vacuna y de segundo anticuerpo monoclonal unido a la forma inmunogénicamente inactiva de la vacuna se determinan midiendo la cantidad de primera y segunda sustancias detectables asociadas a la muestra de vacuna después de la exposición al primer y segundo ligandos. 15

3. El ensayo de la reivindicación 2, en el que la primera y segunda sustancias detectables emiten luz fluorescente de diferentes longitudes de onda cuando están unidas a la forma inmunogénicamente activa de la vacuna y a la forma inmunogénicamente inactiva de la vacuna, respectivamente, y en el que la medición de la cantidad de primer y segundo anticuerpo monoclonal unido a la vacuna se realiza midiendo la luz fluorescente emitida por la primera y segunda sustancias detectables. 20

4. El ensayo de la reivindicación 3, en el que la muestra de vacuna comprende material de vacuna y un adyuvante.

5. El ensayo de la reivindicación 4, en el que la muestra de vacuna se coloca en una placa filtrante antes de la exposición al primer y segundo anticuerpos monoclonales.

6. El ensayo de la reivindicación 5, en el que la placa filtrante comprende dos o más pocillos, en el que la muestra 25 de vacuna se coloca en al menos un pocillo y el adyuvante de control desprovisto de material de vacuna se coloca en al menos otro pocillo que no contiene el material de vacuna, y en el que los primer y segundo anticuerpos monoclonales marcados se añaden a los pocillos en la placa.

7. El ensayo de la reivindicación 6, en el que los pocillos que contienen la muestra de vacuna se lavan después de la adición de los primer y segundo anticuerpos monoclonales para retirar de los pocillos que contienen la muestra de 30 vacuna el exceso de anticuerpo monoclonal que no está unido al material de vacuna antes de medir la luz emitida por las sustancias fluorescentes.

8. El ensayo de la reivindicación 1, en el que la vacuna es una vacuna del virus del papiloma.

9. El ensayo de la reivindicación 8, en el que la vacuna comprende una partícula similar a un virus.

10. El ensayo de la reivindicación 9, en el que la partícula similar a un virus comprende una proteína L1. 35

11. El ensayo de la reivindicación 9, en el que la partícula similar a un virus comprende HPV-16.

12. El ensayo de la reivindicación 11, en el que el epítopo que tiene una conformación asociada a una forma activa de la vacuna es epítopo de V5.

13. El ensayo de la reivindicación 12, en el que el anticuerpo monoclonal capaz de unirse al epítopo en una conformación asociada a la forma inmunogénicamente activa de la vacuna es el anticuerpo monoclonal HPV16.V5. 40

14. El ensayo de la reivindicación 13, en el que el HPV16.V5 está marcado con una sustancia fluorescente.

15. El ensayo de la reivindicación 11, en el que la forma inactiva de la vacuna comprende proteína L1 desnaturalizada.

16. El ensayo de la reivindicación 15, en el que la proteína L1 comprende proteína L1 lineal.

17. El ensayo de la reivindicación 9, en el que la partícula similar a un virus comprende HPV-18. 45