PROCEDIMIENTO PARA EL DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES MEDIANTE LA DETERMINACIÓN DE APOLIPOPROTEÍNA C-I.

Procedimiento para el diagnóstico, la detección precoz, la valoración del riesgo y el control de la evolución de enfermedades cancerosas,

caracterizado por el hecho de que - en una muestra de suero o plasma de un paciente humano se determina aquella porción de la apolipoproteína C-I total que está presente en una muestra y que (I) es detectable mediante determinación directa mediante un inmunoensayo tipo sándwich ("inmunorreactividad de apolipoproteína C-I") y (II) cuyo valor de medición no se ve reducido o no se ve significantemente reducido mediante tratamiento de la muestra con un medio de adsorción con superficies hidrofóbicas, y - de que se deduce la existencia de una enfermedad cancerosa cuando - la inmunorreactividad de apolipoproteína C-I en la muestra está incrementada en comparación con las personas de control sanas y la porción de apolipoproteína C-I que se une a estructuras moleculares hidrofóbicas está significantemente reducida en comparación con las personas de control sanas, de forma tal que - la concentración de apolipoproteína C-I determinada directamente en la muestra con el inmunoensayo y la concentración de apolipoproteína C-I en aquella muestra que fue tratada con un medio de adsorción con superficies hidrofóbicas presentan valores equiparables

La presente invención se refiere a los procedimientos para el diagnóstico, la detección precoz, la valoración del riesgo y el control de la evolución de enfermedades en los que se determina en muestras de suero o plasma de pacientes humanos como biomarcador la proteína apolipoproteína C-I.

Hay que señalar como premisa que cuando en la siguiente descripción se habla en general de “procedimientos 5 diagnósticos”, este concepto representa por regla general y para simplificar a los procedimientos para el diagnóstico, la detección precoz, la valoración del riesgo y el control de la evolución, incluyendo a un control de la evolución como acompañamiento a la terapia, de enfermedades, a no ser que se desprenda del contexto en concreto que se haga en ese sitio referencia tan sólo a mediciones que persigan específicos objetivos limitados.

Además hay que observar que en el contexto de la presente solicitud el concepto de “enfermedades” se usa para 10 enfermedades por regla general severas y crónicas y en particular agudas, y no se refiere a trastornos del lipometabolismo como los que se consideran como factores de riesgo para el desarrollo de una aterosclerosis. Son de destacar como “enfermedades” las enfermedades cancerosas.

Se califican de “apolipoproteínas” las proteínas que forman las lipoproteínas junto con lípidos (triglicéridos, colesterol, fosfolípidos). Una función importante de las apolipoproteínas es la de permitir el transporte de los lípidos hidroinsolubles 15 en el suero y el plasma. Las lipoproteínas se clasifican sobre la base de su comportamiento de migración en el gradiente de densidad de una ultracentrífuga en cuatro distintas clases de densidad: los quilomicrones, las VLDL (de: very low-density lipoproteins = lipoproteínas de muy baja densidad), las LDL (de: low-density lipoproteins = lipoproteínas de baja densidad) y las HDL (de: high-density lipoproteins = lipoproteínas de alta densidad). Adicionalmente se distingue un grupo denominado lipoproteína (a). La porción de lípidos de las lipoproteínas es tanto más baja cuanto más alta es su 20 densidad. Las lipoproteínas de las distintas clases de densidad no se diferencian sobre la base de la cantidad de la porción de lípidos total existente, sino también considerando su composición. Además pueden asignarse a las respectivas clases de densidad también típicos perfiles de apolipoproteínas.

Las apolipoproteínas son proteínas de distinta longitud y composición de aminoácidos que se asignan a grupos denominados con las letras mayúsculas A-H, distinguiéndose de nuevo dentro de los distintos grupos entre distintas 25 proteínas que se caracterizan mediante un número añadido. En lugar de la designación completa de p. ej. apolipoproteína A-I ha adquirido carta de naturaleza también hablar sencillamente tan sólo de apo A-I. Las estructuras primarias (las secuencias de aminoácidos) de las distintas apolipoproteínas son conocidas, y para una serie de las distintas apolipoproteínas existen también datos o ideas concretas sobre su estructura espacial, en particular en asociación con lípidos. Pueden sacarse datos más concretos de la correspondiente literatura científica. 30

Es conocida la técnica de determinar también selectivamente apolipoproteínas en relación con la obtención de datos de medición sobre el lipometabolismo de un paciente, en particular para la detección precoz de un riesgo de aterosclerosis o bien para el control de la terapia en el tratamiento de un paciente con medicamentos lipidorreductores. Al hacer esto se aprovecha la circunstancia de que determinadas apolipoproteínas surgen exclusivamente o al menos preponderantemente en lipoproteínas de las distintas clases de densidad de lipoproteínas anteriormente mencionadas y 35 determinan su especificidad, con lo cual mediante una determinación de la porción de apolipoproteína de las lipoproteínas también puede determinarse la porción de éstas últimas en un suero o plasma de un paciente.

Es también sabido que en determinados pacientes y debido a considerables influencias que influencian la formación de las apolipoproteínas o de las enzimas que las disocian, o que se manifiestan como defectos de los receptores, se encuentran perfiles de lipoproteínas y apolipoproteínas que se desvían de los normales. Es además sabido que también 40 como acompañamiento a otras enfermedades pueden producirse trastornos del lipometabolismo (dislipoproteinemias secundarias) que son de naturaleza temporal y tras la curación de la enfermedad desaparecen de nuevo (véase (20), páginas 186-189; las referencias a la literatura en forma de números entre paréntesis se refieren a la bibliografía adjunta). En la medida en que las modificaciones del lipometabolismo se manifiestan también como modificaciones de las composiciones de apolipoproteínas, en la literatura científica están documentadas en primera línea aquellas 45 modificaciones que afectan a las apolipoproteínas A-I y A-II y que por regla general reflejan formas y concentraciones anormales de las HDL. Las apolipoproteínas no desempeñan sin embargo papel práctico digno de mención alguno como biomarcadores para el diagnóstico de enfermedades para las que es sabido que van también acompañadas de trastornos del lipometabolismo.

En el marco de la presente solicitud se trata de la determinación de la apolipoproteína C-I a efectos diagnósticos. La 50 apolipoproteína C-I pertenece a un grupo de apolipoproteínas con un peso molecular comparativamente bajo, que se denominan apolipoproteínas apo C-I, apo C-II y apo C-III. Las estructuras primarias de estas tres proteínas son conocidas (véanse (1), (2) y, con respecto a la apolipoproteína C-I, en particular (3)). Sobre la función de las apolipoproteínas C-I y C-III se sabe relativamente poco, y sobre las modificaciones de las cantidades y las formas y las formas de asociación de la apolipoproteína C-I en el suero o el plasma humano en dependencia de determinados 55 estados de enfermedad no hay conocimientos documentados de tipo alguno. Son representativas de las publicaciones de la literatura científica que se refieren a las apolipoproteínas del grupo C o a la apolipoproteína C-I publicaciones según (1) a (18), proporcionando en particular el trabajo según (11) una buena visión de conjunto de lo que es sabido sobre el papel que desempeñan las apolipoproteínas C en el metabolismo de las lipoproteínas. Pertenecen a los efectos

biológicos descritos para la apolipoproteína C-I en primera línea la inhibición de la proteína transportadora de ésteres de colesterol (CETP), la amortiguación de la proteína (LRP) relacionada con el receptor de las LDL (LDLR) y del propio LDLR y del receptor de las VLDL (VLDLR), así como la activación de la lecitina-colesterol aciltransferasa (LCAT).

Del contenido de las publicaciones anteriormente mencionadas no son deducibles conocimientos que pudiesen permitir una determinación de apolipoproteína C-I como biomarcador para el diagnóstico de enfermedades tales como p. ej. la 5 sepsis o el cáncer, o que pudiesen sugerir la conveniencia de una determinación de apolipoproteína C-I en los contextos diagnósticos anteriormente mencionados.

La presente invención es el resultado de sistemáticos trabajos de investigación de la solicitante que tienen como objetivo investigar las modificaciones de la composición de proteínas de pacientes con sepsis y hacer selectivamente uso de los resultados obtenidos de la investigación para la diagnosis de sepsis y de inflamaciones. 10

Fue punto de partida de estas investigaciones la constatación de que en la sepsis la prohormona procalcitonina está drásticamente incrementada y de que la determinación de procalcitonina como biomarcador para sepsis para el diagnóstico y para el control evolutivo como acompañamiento a la terapia es de alto valor práctico (véase p. ej. la EP 656 121 B1). Conocimientos de mayor alcance sobre la modificación de la composición de proteínas en el suero o plasma de pacientes de sepsis, que fueron obtenidos por la solicitante partiendo de distintos planteamientos de 15 investigación, se encuentran por ejemplo en la publicación de solicitud de patente EP 1 121 600 A2, así como en adicionales publicaciones de solicitudes de patente de fecha anterior, tales como los documentos WO 02/085937, WO 03/005035, WO 03/002600, EP 1 355 158 A1, EP 1 318 406 A1, EP 1 318 407 A1 y EP 1 355 159 A1, y en adicionales solicitudes de patente aún no publicadas de la solicitante sobre este tema. Se hace referencia al contenido de las mencionadas solicitudes... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para el diagnóstico, la detección precoz, la valoración del riesgo y el control de la evolución de enfermedades cancerosas, caracterizado por el hecho de que

- en una muestra de suero o plasma de un paciente humano se determina aquella porción de la apolipoproteína C-I total que está presente en una muestra y que (I) es detectable mediante determinación directa 5 mediante un inmunoensayo tipo sándwich (“inmunorreactividad de apolipoproteína C-I”) y (II) cuyo valor de medición no se ve reducido o no se ve significantemente reducido mediante tratamiento de la muestra con un medio de adsorción con superficies hidrofóbicas, y

- de que se deduce la existencia de una enfermedad cancerosa cuando

- la inmunorreactividad de apolipoproteína C-I en la muestra está incrementada en comparación con las 10 personas de control sanas y la porción de apolipoproteína C-I que se une a estructuras moleculares hidrofóbicas está significantemente reducida en comparación con las personas de control sanas, de forma tal que

- la concentración de apolipoproteína C-I determinada directamente en la muestra con el inmunoensayo y la concentración de apolipoproteína C-I en aquella muestra que fue tratada con un medio de adsorción con superficies hidrofóbicas presentan valores equiparables. 15

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que para el tratamiento de la muestra con un medio de adsorción con superficies hidrofóbicas se somete a una muestra de suero o plasma a una cromatografía de interacción hidrofóbica en la que se fija al material cromatográfico apolipoproteína C-I libre.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado por el hecho de que como material cromatográfico se usa octilsefarosa. 20