Elemento de prueba para la determinación de la coagulación en una muestra de plasma o de sangre total que posee una primera superficie (2a) y una segunda superficie (4a) a una distancia predeterminada una frente a otra,

estando provistas dichas ambas superficies de dos modelos sustancialmente equivalentes que forman zonas de alta y baja energía superficial que están alineados de forma esencialmente congruente, con lo cual las zonas de alta energía superficial crean un sistema de distribución de muestras (6) con al menos dos zonas de detección de la coagulación (6a1, 6a2), caracterizado porque al menos una de las zonas de detección (6a, 6''a) de la primera y la segunda superficies (2a, 4a) está provista de al menos un reactivo estimulante de la coagulación

Sistema de ensayo de la coagulación.

Campo de la invención

La invención se refiere a un sistema de ensayo de la coagulación para medir la coagulación sanguínea en una muestra de fluido fisiológico.

Antecedentes de la invención

El proceso de coagulación de la sangre es complejo e implica a una gran cantidad de componentes sanguíneos, incluyendo la generación de fibras de fibrina. Las fibras se forman por la polimerización de las moléculas de una proteína denominada fibrinógeno. El fibrinógeno es catalizado a partir de una enzima llamada trombina, que es catalizada a su vez por la enzima protrombina.

El ensayo de tiempo de la protrombina (ensayo PT) se emplea comúnmente en hospitales, clínicas y laboratorios para determinar la capacidad de coagulación de una muestra de sangre. El ensayo es ampliamente utilizado para la evaluación preoperatoria, así como para la terapia anticoagulante administrada por ejemplo a pacientes cardíacos. El ensayo PT se basa en el período de tiempo necesario para que una muestra de sangre se coagule bajo la influencia de ciertos reactivos, tales como iones calcio y tromboplastina.

De forma similar, los individuos que padecen enfermedades cardíacas y vasculares y/o que tienen válvulas cardíacas mecánicas a menudo son tratados con un régimen diario de medicamentos que retardan la coagulación sanguínea, denominados comúnmente como anticoagulantes. Para que la cantidad de anticoagulante en el torrente sanguíneo sea eficaz, se debe mantener a un nivel considerado apropiado por el médico. La consecuencia de cantidades inadecuadas de anticoagulante en el torrente sanguíneo es grave, conduciendo a apoplejías o hemorragias.

Los pacientes que logran este equilibrio deben soportar visitas frecuentes, onerosas e inoportunas a la clínica, donde se puede controlar de cerca la capacidad de la sangre para coagularse. El control se realiza con mediciones periódicas PT tal como se miden por el Coeficiente Internacional Normalizado (INR). Por ejemplo, un INR superior a 3 resulta en un riesgo más alto de hemorragia seria, mientras que un INR de 6 incrementa el riesgo de desarrollar un sangrado serio en cerca de 7 veces el correspondiente a un INR por debajo de 3. Por otra parte, un INR por debajo de 2 se asocia con un mayor riesgo de apoplejía. Por tanto, se recomienda el control del tiempo de protrombina para asegurar que los niveles de dosis se encuentran dentro del rango terapéutico.

Cuando se controlan componentes tales como los niveles de fibrinógeno y de protrombina en sangre, el médico puede adquirir datos significativos sobre la capacidad de coagulación sanguínea de un paciente o sobre otras condiciones clínicas. Las proteínas que están involucradas en el proceso de coagulación se denominan habitualmente factores. Los factores se numeran del I al XIII y los especialistas se refieren a un factor por su número identificando la proteína correspondiente.

La activación de la protrombina tiene lugar como resultado de la acción del Factor Xa de coagulación sanguínea, que se forma por la activación del Factor X durante la proteólisis. Existen dos vías moleculares que llevan a la activación del Factor X para producir Xa, generalmente conocidas como vías extrínsecas e intrínsecas de la coagulación sanguínea. La vía extrínseca utiliza solamente un factor específico de tejido de una membrana lesionada, mientras que la vía intrínseca utiliza sólo factores internos de la sangre circulante. Ambas vías surgen de la interacción de las enzimas implicadas en el proceso de coagulación sanguínea con las proteínas superficiales y los fosfolípidos.

Se han empleado diversos ensayos para medir el proceso de coagulación en ambas vías, extrínseca e intrínseca, de una muestra de sangre de un paciente. Por ejemplo, la prueba del Tiempo de Tromboplastina Parcial Activado (APTT) mide los factores de coagulación de la vía intrínseca. Estos factores incluyen los Factores XII, XI, X, IX, VIII, V, II y I, que pueden ser anormales debido a la herencia, a una enfermedad o a los efectos de una terapia con heparina. Por tanto, la prueba APTT es útil como criba prequirúrgica y para controlar la terapia con heparina. De forma similar, las pruebas de velocidad de polimerización del fibrinógeno utilizando una prueba de Tiempo de Trombina (TT) o una prueba cuantitativa de fibrinógeno proporcionan datos útiles para el diagnóstico de pacientes en terapia con Warfarina (marca: Coumadine®) o con productos farmacéuticos relacionados.

Tal como se ha mencionado anteriormente, la prueba más comúnmente utilizada para controlar la terapia con anticoagulantes es la prueba del tiempo de protrombina en una etapa. La reacción medida por la prueba PT es:

Sangre + Tromboplastina + Ca⁺⁺ rightarrow Coágulo de Fibrina

La tromboplastina es una preparación fosfolípido-proteína que activa la coagulación en especímenes sanguíneos. Diferentes fabricantes disponen comercialmente de tromboplastinas y éstas se pueden obtener a partir de extractos de pulmón, cerebro o placenta y se pueden fabricar sintéticamente. En general, los valores PT entre distintos laboratorios no coinciden, siendo por ello tales valores inaceptables para definir los rangos terapéuticos para la terapia con anticoagulantes.

Por ello, se desarrolló un Coeficiente Internacional Normalizado (INR) y éste fue adoptado por la Organización Mundial de la Salud a principios de los años 80. El objeto del coeficiente normalizado era estandarizar los resultados procedentes de varios analizadores de tromboplastinas y de coagulación para que fueran equivalentes. Por consiguiente, con el coeficiente, un fabricante atribuye un Índice de Sensibilidad Internacional (ISI) a cada lote de tromboplastina, indicando la sensibilidad relativa de la tromboplastina con respecto a una tromboplastina de referencia internacional. Por ejemplo, si una tromboplastina tiene la misma sensibilidad que la tromboplastina de referencia, entonces el ISI es 1,0. Un valor de ISI superior a 1,0 indica que la tromboplastina no es tan sensible como la tromboplastina de referencia. Se utiliza la ecuación que figura más abajo para calcular el valor INR utilizando un valor PT y un valor ISI:

El PT medio-normal se determina en cada laboratorio haciendo el promedio de los valores PT a partir de un número de individuos sanos.

La detección de la formación de coágulos de fibrina se remonta a mediados de 1850 y los primeros métodos eran manuales. En 1910 se desarrolló un aparato para determinar el cambio de viscosidad de una muestra de sangre cuando experimentaba la coagulación. El aparato proporcionaba una indicación directa del voltaje, que se podía representar frente al tiempo de coagulación. En los años 20, destacaron las técnicas fotoeléctricas para detectar variaciones en la transmisividad a la luz de una muestra de sangre durante la coagulación con variaciones en la transmisividad óptica de la muestra observadas con un galvanómetro. Otras investigaciones sobre la coagulación de plasma sanguíneo por técnicas fotoeléctricas mejoradas se realizaron a mediados de los años 30 con un aumento de la densidad óptica a medida que se observaba la sangre coagulada. Esto condujo al desarrollo de un instrumento que mostraba un aumento de la densidad a medida que se formaba un coágulo.

Así, los sistemas modernos de detección de la densidad óptica funcionan según el principio de que un incremento en la densidad óptica de una muestra de coagulación disminuye la transmisividad a la luz a través de la muestra. En un sistema típico de detección de la densidad óptica, se coloca una muestra de sangre de prueba en una cubeta transparente de muestra y se somete a reacción con un reactivo estimulante de la coagulación tal como tromboplastina. La radiación electromagnética o la luz en el espectro visible o casi infrarrojo atraviesa entonces la mezcla de reactivo y plasma a medida que la muestra coagula. Como el cambio bioquímico que lleva a la formación de fibrina tiene lugar dentro de la muestra, la densidad óptica de la muestra aumenta. Los voltajes de salida correspondientes a la densidad óptica de la muestra permiten, después del procesamiento con una unidad de procesamiento, determinar la coagulación de la muestra.

Aunque se ha reconocido durante mucho tiempo la existencia de la relación entre los niveles de fibrinógeno (fibrina) y la densidad óptica, ha habido un importante desacuerdo sobre la naturaleza...

1. Elemento de prueba para la determinación de la coagulación en una muestra de plasma o de sangre total que posee una primera superficie (2a) y una segunda superficie (4a) a una distancia predeterminada una frente a otra, estando provistas dichas ambas superficies de dos modelos sustancialmente equivalentes que forman zonas de alta y baja energía superficial que están alineados de forma esencialmente congruente, con lo cual las zonas de alta energía superficial crean un sistema de distribución de muestras (6) con al menos dos zonas de detección de la coagulación (6a1, 6a2), caracterizado porque al menos una de las zonas de detección (6a, 6'a) de la primera y la segunda superficies (2a, 4a) está provista de al menos un reactivo estimulante de la coagulación.

2. Elemento de prueba de la coagulación según la reivindicación 1, caracterizado porque al menos una zona de detección de coagulación está provista de una formulación que contiene un acelerador de la coagulación que potencia una coagulación rápida y completa del fluido de muestra.

3. Elemento de prueba de la coagulación según la reivindicación 1, caracterizado porque al menos una zona de detección de coagulación está provista de una formulación que contiene un inhibidor de la coagulación que suprime la coagulación en el fluido de muestra.

4. Elemento de prueba de coagulación según la reivindicación 1, caracterizado porque el sistema de distribución de muestras (6) comprende al menos tres zonas de detección de la coagulación, estando provista al menos una zona de detección de la coagulación de una formulación que acelera la coagulación del fluido de muestra y estando provista al menos una zona de detección de la coagulación de una formulación que suprime la coagulación en el fluido de muestra.

5. Elemento de prueba de la coagulación según al menos una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el(los) reactivo(s) estimulante(s) de la coagulación es(son) tromboplastina y/o iones calcio.

6. Elemento de prueba de la coagulación según al menos una de las reivindicaciones 2, 4 ó 5, caracterizado porque la formulación que acelera la coagulación del fluido de muestra comprende un agente gelificante.

7. Elemento de prueba de la coagulación según al menos una de las reivindicaciones 3, 4, 5 ó 6, caracterizado porque la formulación que inhibe la coagulación en el fluido de muestra comprende heparina de litio y/o EDTA.

8. Elemento de prueba de la coagulación según al menos una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque al menos una de las superficies primera y segunda (2a, 4a) de la(s) zona(s) de detección (6a, 6'a) está(n) provista(s) de un compuesto que permite la determinación de la reacción de coagulación mediante fotometría de transmisión o absorbancia.

9. Elemento de prueba de la coagulación según al menos una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque al menos una de las superficies primera y segunda (2a, 4a) de la(s) zona(s) de detección (6a, 6'a) está(n) provista(s) de(un) compuesto(s) que permite(n) la determinación de la reacción de coagulación mediante fluorescen-cia.

10. Elemento de prueba de la coagulación según la reivindicación 9, caracterizado porque el(los) compuesto(s) que permite(n) la determinación de la reacción de coagulación mediante fluorescencia es(son) (un) rotor(es) molecu- lar(es) fluorescente(s).

11. Método para preparar un elemento de prueba de la coagulación que comprende las etapas de:

12. Método según la reivindicación 11, que comprende las etapas adicionales de:

13. Método según la reivindicación 11 ó 12 que comprende la etapa adicional de:

14. Método para preparar un elemento de prueba de la coagulación según una de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizado porque dichas zonas de alta energía superficial se crean mediante la aplicación de una composición hidrofílica insoluble en agua sobre la primera y la segunda superficies (2a, 4a).

15. Método para preparar un elemento de prueba de la coagulación según una de las reivindicaciones 11 a 14, caracterizado porque dichas zonas de baja energía superficial se crean mediante la aplicación de composiciones hidrofóbicas sobre la primera y la segunda superficies (2a, 4a).

16. Método para preparar un elemento de prueba de la coagulación según una de las reivindicaciones 14 y 15, caracterizado porque dicha(s) composición(es) hidrofílica(s) y/o hidrofóbica(s) está(n) impresa(s) sobre la primera y la segunda superficies (2a, 4a) por medio de flexografía, litografía, grabado, método de recubrimiento con tinta sólida o impresión por chorro de tinta.

17. Método para preparar un elemento de prueba de la coagulación según una de las reivindicaciones 11 a 16, caracterizado porque dicho(s) reactivo(s) estimulante(s) de la coagulación y/o formulación(es) de control de calidad y/o asistente(s) de detección de fluorescencia recubre(n) las zonas de detección (6a, 6'a) de la primera y/o la segunda superficies (2a, 4a) mediante impresión por microcontacto o microdispensación.

18. Sistema de prueba de la coagulación para la determinación de la coagulación en una muestra de plasma o de sangre total que comprende:

19. Método para determinar la coagulación en un fluido de muestra de suero o de sangre total, comprendiendo dicho método: