DETECCIÓN DE SUSTANCIAS BASADAS EN FLUORESCENCIA.

Un procedimiento para la detección fluorescente de una sustancia en una huella dactilar de un ser humano sobre una superficie de un sustrato,

procedimiento que comprende: proporcionar partículas que comprenden un núcleo de metal o de óxido metálico, en el que uno o más anticuerpos opcionalmente fluorescentemente marcados u oligómeros de ácido nucleico de péptido específico humano (PNA) para la unión con una sustancia está/están unido/s, directamente o indirectamente, a la superficie del metal u óxido metálico; poner en contacto un sustrato, que puede o puede no tener la sustancia sobre su superficie, con las partículas durante un tiempo suficiente para permitir que el anticuerpo/oligómero de PNA se una a la sustancia; eliminar aquellas partículas que no se han unido al sustrato; si los anticuerpos u oligómeros de PNA no están fluorescentemente marcados, poner en contacto el sustrato con uno o más fluoróforos que se unen selectivamente al anticuerpo y/o sustancia, luego lavar opcionalmente el sustrato para eliminar los fluoróforos sin unir; e iluminar el sustrato con radiación apropiada para mostrar los fluoróforos sobre el sustrato, en el que el sustrato tiene una huella dactilar de un ser humano sobre una superficie sobre la que las partículas se ponen en contacto.

La presente invención se refiere a la detección de sustancias que incluye, pero no se limita a, sustancias biológicas, fármacos y/o metabolitos usando fluorescencia. La presente invención puede usarse para detectar la presencia de ciertos compuestos en sustancias secretadas por seres humanos, por ejemplo, en una huella dactilar dejada sobre un sustrato.

Los científicos forenses frecuentemente encuentran huellas dactilares y sustancias biológicas en la escena de un crimen. Actualmente, los examinadores forenses inicialmente buscan indicios de sangre, semen y saliva a simple vista. Esto va seguido de un examen usando fuentes de luz especializadas. El semen y la saliva presentan fluorescencia bajo ciertas, pero ni mucho menos todas las circunstancias. La sangre no tiene fluorescencia nativa, pero tiene una fuerte banda de absorción centrada alrededor de 415 nm. De ahí que pueda 'visualizarse' bajo fuentes de luz como una mancha oscura en comparación con un fondo más claro. Esto no funciona en muchos sustratos, ni cuando manchas minúsculas de sangre están presentes o cuando el autor de un crimen ha intentado limpiar los rastros. Cuando la inspección visual y con fuente de luz ha fracaso en la indicación de la presencia de fluidos corporales, los examinadores de la escena se basan en la presentación de la prueba 'mejor estimada', presentando artículos para el examen adicional que creen que pueden ser una fuente de ADN (por ejemplo, ropa interior, colillas de cigarrillos, etc.). Estos enfoques frecuentemente fracasan en la detección de rastros de fluidos corporales. Aún cuando el examen visual o con fuente de luz ha revelado lo que podría ser sangre, semen o saliva, esto es presuntamente y adicionalmente colorimétrico y, en el caso de presunto semen, se requieren pruebas microscópicas para confirmar la presencia de los diversos fluidos. Se requiere una prueba separada para cada fluido corporal, con diferentes procedimientos y reactivos usados para cada una. Por tanto, existe el deseo de crear una prueba que pueda detectar más fácilmente una o más sustancias que puedan derivarse de un ser humano tales como saliva, sangre, semen y metabolitos.

La identificación de huellas dactilares es una de las piedras angulares de las pruebas forenses. Sin embargo, actualmente una huella dactilar es solamente útil cuando la policía u otras agencias de seguridad puedan obtener un resultado positivo con aquellas huellas presentes en bases de datos.

Cuando se visualiza bajo un microscopio, la piel sobre las palmas aparece como arrugas y ranuras. Es el patrón de estas arrugas de la piel por fricción el que produce la única huella dactilar. Cada arruga de la piel tiene una única fila de poros por la que se secreta el sudor y se deposita sobre la superficie de la piel. Cuando un dedo toca una superficie, el sudor se deposita dejando una impresión del patrón de arrugas del dedo denominado en lo sucesivo una huella dactilar latente. Tales huellas dactilares se consideran 'huellas invisibles' ya que requieren tratamientos físicos o químicos para permitir la visualización.

El sudor es el ultrafiltrado del plasma en sangre que contiene iones inorgánicos, lactato, urea y aminoácidos y estas especies están, por tanto, presentes dentro de una huella dactilar recientemente depositada. Además, se sabe que los fármacos ingeridos y metabolizados por vía oral son secretados en el sudor. Estos fármacos se han medido en sudor mediante el uso de dispositivos de recogida tales como parches de algodón adsorbente, seguido de extracción y posterior análisis usando técnicas tales como detección por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG-EM). Sin embargo, los procedimientos son laboriosos, requieren una gran cantidad de sudor recogido durante un periodo de tiempo y, por tanto, no son adecuados para el análisis rápido, por ejemplo, pruebas en carretera de personas que se sospecha que están conduciendo bajo la influencia de fármacos. La detección de sustancias en huellas dactilares no ha sido posible usando los procedimientos de la técnica anterior debido a la pequeña cantidad de sustancias en la huella dactilar.

La presente invención usa una partícula para su uso en un procedimiento de detección de fluorescencia de una sustancia, comprendiendo la partícula un metal o un óxido metálico, en el que uno o más anticuerpos para la unión a una sustancia está/están unidos, directamente o indirectamente, a la superficie del metal u óxido metálico. Preferentemente, el anticuerpo o cada anticuerpo está unido a la superficie del metal u óxido metálico mediante proteína A o proteína G, o cualquier otra proteína y/o ligador químico, tal como un enlace tiolato, que configura el anticuerpo de forma que esté disponible para unirse a la sustancia que va a detectarse.

La presente invención usa un procedimiento para preparar las partículas que comprende hacer reaccionar partículas que comprenden un metal o un óxido metálico con un anticuerpo para permitir la unión del anticuerpo a la partícula. Las partículas pueden cada una comprender una o más proteínas A y/o proteínas G unidas a la superficie del metal u óxido metálico.

La presente invención proporciona un procedimiento para la detección fluorescente de una sustancia como se define en la reivindicación 1.

Las partículas comprenden un metal o un óxido metálico. Preferentemente, las partículas comprenden oro. Las partículas pueden ser partículas de oro o las partículas pueden comprender un núcleo que comprenda opcionalmente óxido de hierro (Fe3O4 y/o Fe2O3) que tiene una capa de metal sobre el mismo. La capa de metal puede incluir uno o más de oro, plata, platino y cobre.

Las partículas tienen preferentemente un diámetro inferior a 1 μm, más preferentemente inferior a 100 nm, lo más preferentemente inferior a 30 nm. A partir de ahora las partículas se llamarán nanopartículas.

Las nanopartículas de metal y óxido metálico pueden sintetizarse y recubrirse con anticuerpos monoclonales y/o policlonales específicos para cada sustancia de interés, por ejemplo, el fluido biológico diana. La partícula resultante que tiene un metal y/u óxido metálico unido a un anticuerpo puede llamarse conjugado anticuerpo-nanopartícula. Cada anticuerpo puede entonces marcarse con fluoróforos individuales o múltiples para permitir la diferenciación del fluido diana. Los conjugados anticuerpo-nanopartícula pueden usarse en la detección y la diferenciación de sangre, semen y saliva, y en la detección de ADN y otras sustancias de interés. Las partículas actuarán de soportes sólidos para los anticuerpos. El tamaño nanométrico de las partículas proporciona una gran área superficial y, por tanto, una alta concentración del anticuerpo sobre la superficie de la partícula. Esto proporcionará múltiples sitios de unión para las especies diana, aumentando así la sensibilidad de detección por fluorescencia.

Los presentes inventores han encontrado que pueden crear estructuras de monocapa que rodean partículas de dimensiones a escala nanométrica (4-100 nm) basándose en técnicas de autoensamblaje. Las partículas pueden crearse en disolución acuosa y formar una suspensión estable. Para la deposición de anticuerpos es necesario fabricar los conjugados anticuerpo-nanopartícula usando disoluciones acuosas para evitar la desnaturalización de la biomolécula.

Las partículas pueden ser o pueden comprender nanopartículas de oro. El enfoque clásico para la fabricación de nanopartículas de oro basadas en acuosas es el informado por Turkevich1. Como se describe en Turkevich, las nanopartículas de oro pueden formarse mediante la reducción de citrato de HAuCl4. Y, lo que es más importante, el citrato no sólo reduce la sal metálica, sino que también actúa de agente de apelmazamiento estabilizando las partículas y previniendo la agregación. Adicionalmente, la capa de citrato es fácilmente desplazada cuando un ligando que contiene un resto tiol / disulfuro se añade a una disolución de las partículas. Los anticuerpos fluorescentemente marcados se depositarán sobre las partículas usando tanto ligandos químicos como de proteína para facilitar la formación de monocapas sobre la superficie de la nanopartícula.

Como se muestra en el siguiente ejemplo, los presentes inventores han ideado un procedimiento simple y robusto para la formación de una monocapa de anticuerpo usando un ligador de proteína para recubrir la superficie de las nanopartículas de oro -la construcción de los conjugados anticuerpo-nanopartícula se muestra esquemáticamente... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para la detección fluorescente de una sustancia en una huella dactilar de un ser humano sobre una superficie de un sustrato, procedimiento que comprende:

proporcionar partículas que comprenden un núcleo de metal o de óxido metálico, en el que uno o más anticuerpos opcionalmente fluorescentemente marcados u oligómeros de ácido nucleico de péptido específico humano (PNA) para la unión con una sustancia está/están unido/s, directamente o indirectamente, a la superficie del metal u óxido metálico; poner en contacto un sustrato, que puede o puede no tener la sustancia sobre su superficie, con las partículas durante un tiempo suficiente para permitir que el anticuerpo/oligómero de PNA se una a la sustancia; eliminar aquellas partículas que no se han unido al sustrato; si los anticuerpos u oligómeros de PNA no están fluorescentemente marcados, poner en contacto el sustrato con uno o más fluoróforos que se unen selectivamente al anticuerpo y/o sustancia, luego lavar opcionalmente el sustrato para eliminar los fluoróforos sin unir; e iluminar el sustrato con radiación apropiada para mostrar los fluoróforos sobre el sustrato, en el que el sustrato tiene una huella dactilar de un ser humano sobre una superficie sobre la que las partículas se ponen en contacto.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el núcleo comprende uno o más metales seleccionados de oro, plata, platino y cobre.

3. El procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que el núcleo comprende un óxido de hierro.

4. El procedimiento según la reivindicación 2 o la reivindicación 3, en el que las partículas tienen un núcleo que comprende un óxido de hierro, teniendo el núcleo una capa de metal sobre el mismo, estando el metal seleccionado de oro, plata, platino y cobre.

5. El procedimiento según la reivindicación 3 ó 4, en el que el óxido de hierro es Fe3O4 o Fe2O3.

6. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que al menos algunos de los núcleos de partículas tienen un diámetro inferior a 100 nm.

7. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el uno o más anticuerpos u oligómeros de PNA están directamente unidos a la superficie del metal u óxido metálico.

8. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el uno o más anticuerpos u oligómeros de PNA están unidos a la superficie del metal u óxido metálico mediante un ligador que contiene azufre.

9. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y 8, en el que el uno o más anticuerpos u oligómeros de PNA están unidos a la superficie del metal u óxido metálico mediante proteína A o proteína G.

10. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, 8 y 9, en el que el uno o más anticuerpos u oligómeros de PNA están unidos a la superficie del metal u óxido metálico del siguiente modo:

[anticuerpo u oligómero de PNA]-[Proteína A o G]-NH-CO-(CH2)n-S-[superficie de metal o de óxido metálico]

en la que n es 1 a 5 y NH es parte de la proteína A o la proteína G.

11. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el uno o más anticuerpos se unen selectivamente a histona H1, cocaína, benzoilecgonina, nicotina, cotinina, uno o más esteroides, TNT o RNX.

12. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el uno o más anticuerpos se seleccionan de amilasa salival humana, antígeno específico de la próstata, proteína glucoforina de la membrana eritrocitaria (CD235a), albúmina de suero humano, antígeno leucocitario común (CD45) y un anticuerpo citoplásmico anti-neutrófilo (ANCA) opcionalmente seleccionado de (i) p-ANCA (mieloperoxidasa) y (ii) c-ANCA (proteinasa 3 (PR3)).