La presente invención se relaciona con la Inmunología y más específicamente con composiciones inmunogénicas que contienen péptidos,

polipéptidos, proteínas, sus correspondientes secuencias de ADN, células o sus lisados y proteoliposomas de muy pequeña talla (VSSP), formados estos últimos al unir el complejo de proteínas de la membrana externa (CPME) de Neisseria meningitidis con gangliósidos, mediante enlaces hidrófobos. En particular esta invención muestra como preparar composiciones inmunoestimuladoras capaces de generar respuestas inmunes antígeno-específicas inclusive en huéspedes inmunocomprometidos, como son los que padecen de cáncer e infecciones de origen viral o bacterianas crónicas. En estos pacientes, la administración de las composiciones vacunales descritas permite restaurar la funcionalidad de sectores de su sistema inmunitario. Las composiciones vacunales de esta invención pueden ser utilizadas para proteger de o tratar enfermedades infecciosas, malignas o autoinmunes

Sector Técnico.

La presente invención se refiere a la medicina humana y en especial con vacunas protectoras y/o terapéuticas que confieren protección frente a enfermedades infecciosas, autoinmunes y el cáncer, y particularmente proporciona composiciones vacunales que permiten la generación o el incremento de la respuesta inmunitaria contra antígenos poco inmunogénicos. Técnica Anterior.

El poco éxito logrado hasta ahora en la prevención y tratamiento de un grupo de enfermedades infecciosas, el cáncer y las enfermedades autoinmunes con vacunas se debe a combinaciones de factores diversos, principalmente la baja inmunogenicidad de antígenos relevantes, el desconocimiento de como manipular la regulación del sistema inmunitario y las estrategias de evasión de patógenos y tumores, entre ellas la inmunosupresión del hospedante.

Son conocidos dentro del estado de la técnica como antígenos poco inmunogénicos aquellos péptidos, polipéptidos y proteínas (o sus correspondientes secuencias de ADN) presentes en tumores y tejidos normales, o asociados a patógenos que producen infecciones crónicas mediante la evasión de la acción del sistema inmunitario.

Entre los antígenos poco inmunogénicos los receptores de factores de crecimiento con actividad quinasa en restos de tirosina han mostrado tener una estrecha relación con el desarrollo de tumores y de metástasis tumorales, y se ha probado su valor en algunos casos como indicadores de mal pronóstico en cáncer. Tal es el caso de receptores como el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR, siglas en inglés) o HER-1, el receptor del factor de crecimiento epidérmico 2 (HER2), y el receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-R, siglas en inglés).

La sobreexpresión de estos receptores en algunos tipos de neoplasias, fundamentalmente de origen epitelial, ha sido diana de atención en la inmunoterapia del cáncer. Tal es el caso de tumores de mama, vejiga, ovario, vulva, colon, pulmón, cerebro, próstata y tumores de cabeza y cuello. La presencia de EGF-R ha probado ser una indicación de mal pronóstico en cáncer de mama (Pérez R et al. 1984. Breast Cancer and Treatment 4:189-193). Aun cuando no se conoce todavía el papel que juega el sistema del EGF/EGF-R en la regulación del crecimiento tumoral, se ha sugerido que la expresión del EGF-R en células tumorales proporciona un mecanismo para la estimulación autocrina que conduce a la proliferación descontrolada de dichas

células (Schlessinger J et al. (1983) Crit Rev Biochem 14 (2):93-111).

Por su alta expresión en tumores, el receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico ha sido diana de inmunoterapia pasiva (IP) con anticuerpos monoclonales en forma nativa, asociados con fármacos, toxinas, o isótopos radiactivos (Vollmar AM et al. (1987) J Cell Physiol 131:418-425). Varios ensayos clínicos con anticuerpos monoclonales (AcMs) se están llevando a cabo y algunos han mostrado resultados promisorios, como es el caso del ensayo clínico con el AcM C225 en cáncer de mama, de células pancreáticas y de células renales en fase II y cabeza-cuello en fase III (Mendelsohn J et al. (1999) American Society of Clinical Oncology Meeting). Otro ensayo clínico de Fase II con buenos resultados es el ensayo efectuado con el AcM IOR egf/r3 en tumores de cabeza y cuello (Crombet T el al. (2000) Cancer Biotherapy and Biopharmaceutical, manuscrito aceptado).

En cambio la inmunoterapia activa específica (lAE) utilizando como diana el EGF-R no ha sido nunca desarrollada, siendo las causas de esto su baja inmunogenicidad como molécula propia y su amplia expresión en los tejidos del organismo, lo cual ha determinado el temor de los inmunólogos a considerar esta opción (Disis ML and Cheever MA (1996) Current Opinion in Immunology 8:637-642). La lAE tiene ventajas sobre la IP por cuanto ésta última no activa la rama efectora celular específica de la respuesta inmune, y su efecto depende de la vida media de los anticuerpos utilizados, siendo generalmente necesario reinfusiones continuadas para lograr los efectos deseados.

En el desarrollo de vacunas eficaces, los vehículos y adyuvantes deben actuar superando la baja inmunogenicidad de los antígenos relevantes mediante la regulación conveniente del sistema inmunitario y conspirar conjuntamente contra las estrategias de evasión de patógenos y tumores. Es por ello que la búsqueda de nuevos sistemas de vehiculización y adyuvación constituyen hoy una importante área de investigación.

En los últimos años las nuevas teorías y conocimientos emergentes sobre la regulación del sistema inmune han abierto nuevos campos de experimentación para el desarrollo de nuevos vehículos y adyuvantes de mayor eficiencia. Fearon, et al. (Science, Vol.272, pp 50-53,1996) han enseñado que una inmunidad protectora es el resultado de la interrelación de dos sistemas cardinales: la inmunidad innata y la inmunidad adquirida. Las células responsables de la inmunidad adquirida no pueden distinguir las estructuras que requieren respuesta inmune de aquellas que no y por tanto necesitan ser instruidas por las células del sistema inmune innato. Un vínculo esencial entre la inmunidad innata y la adquirida es proporcionado por las Células Presentadoras de Antígenos (APC, siglas en inglés), entre las cuales las Células Dendríticas (DC, siglas en inglés) son las más eficientes inductoras de respuestas inmunes tanto primarias como secundarias. En particular las DC son cruciales debido a que son las únicas APC capaces de activar linfocitos T vírgenes.

Recientemente se han identificado moléculas relacionadas con la inmunidad innata que podrían considerarse como una nueva generación de vehículos y adyuvantes, debido a que tienen la capacidad de madurar las DC y mediar la presentación cruzada de antígenos acopiados a ellas.

En este sentido, una serie de trabajos dentro del estado de la técnica, una serie de trabajos. Giroir, (Crit. Care Med., Vol.5, pp 780-789, 1993), Cella, et al. (Nature, Vol.388, pp 782-787. 1997) y Hailman, et al. (J. Exp. Med., Vol. 79, pp 269-277. 1994) enseñan como la interacción del lipopolisacárido (LPS) con los sistemas de reconocimiento de la inmunidad innata es la más potente de todas, estimulando en monocitos, macrófagos y neutrófilos la producción de citoquinas y de mediadores proinflamatorios, aumentando además la expresión de moléculas de adhesión. Estas citoquinas inflamatorias son muy importantes en la respuesta a infecciones y tumores, pero una excesiva secreción de las mismas conduce al 'shock séptico', lo cual puede ser mortal para los pacientes e impide el uso del LPS como adyuvante vacunal. La respuesta está mediada por el complejo que forma el LPS con la proteína unidora de LPS (LBP, siglas en inglés), el cual a su vez interacciona con la molécula CD14. Esta molécula facilita la interacción del LPS con las moléculas de señalización llamadas receptores Toll (TLR). Numerosas evidencias apuntan al receptor Toll 4 (TLR4) como la molécula de la familia Toll involucrada en la transducción de la señal del LPS.

Ulrich, et al (In Vaccine Design: The subunit and adjuvant approach p 495, edited by MF Powel and MJ Newman, Plenum Press, New York. 1995), Tholen, et al. (Vaccine, Vol.16, p 708. 1998), De Becker, et al. (Int. Immunol, Vol.12, pp 807-815. 2000) indican como existen derivados no tóxicos de LPS, como es el caso del Monofosforil Lípido A (MPLA, siglas en inglés), que tiene actividad adyuvante para las ramas celular y humoral de la respuesta inmune y ha sido administrado a humanos en varios ensayos clínicos. Aunque se sostiene que el MPLA mantiene las propiedades inmunoestimuladoras del LPS, estos autores demostraron que el MPLA induce migración y maduración funcional de las DC in vivo, pero a niveles inferiores a los observados con el LPS.

Tamura, et al (Science, Vol. 278, pp 117-120. 1997) y Binder, et al (Nature Immunol., Vol. 1, pp 151-155. 2000) han descrito como las proteínas de estrés térmico (HSP) son potentes vehículos para la estimulación de la inmunidad celular a través del fenómeno de presentación cruzada de sus antígenos acompañantes. Las HSP obtenidas de tumores han mostrado interesantes efectos antitumorales en distintos modelos. La identificación del CD91 como el receptor para la HSP gp96, podría reflejar la presencia de una vía específica de captura de HSP en las DC que ha evolucionado para reclutar eficientemente péptidos asociados a antígenos, agentes infecciosos o células dañadas, para su presentación en Complejo Mayor de Histocompatibilidad tipo I (MHC I, siglas...

1. Una composición farmacéutica que potencia la inmunogenicidad de

antígenos poco inmunogénicos, que contiene: 5 (A) uno o más antígenos poco inmunogénicos;

(B) un vehículo vacunal que consiste en proteoliposomas derivados del complejo de proteínas de la membrana externa de una bacteria Gram-negativa (Neisseria meningitidis) que contienen gangliósidos incorporados; y

(C) eventualmente uno o más adyuvantes. 10

2. Una composición según la reivindicación 1, donde los antígenos poco inmunogénicos pueden seleccionarse del grupo que consiste en péptidos, o polipéptidos, o proteínas, o sus correspondientes secuencias de ácidos nucleicos, o células diana de interés vacunal, o sus lisados, o mezclas de ellos.

3. Una composición según la reivindicación 2, donde los antígenos poco inmunogénicos o sus dominios extracelulares son receptores de factores de crecimiento.

4. Una composición según la reivindicación 3, donde los dominios extracelulares de los receptores de factores de crecimiento pueden contener o no la región transmembrana.

5. Una composición según las reivindicaciones 3 y 4, donde los receptores de factores de crecimiento son el HER-1, HER-2, R-PDGF o cualquiera de sus variantes que contenga el dominio extracelular con y sin región transmembrana.

6. Una composición según reivindicación 1, donde los proteoliposomas del vehículo vacunal se obtienen del complejo de proteínas de la membrana externa de Neisseria meningitidis, ya sea proveniente de una cepa salvaje o de una modificada genéticamente.

7. Una composición según la reivindicación 1, donde los proteoliposomas

del vehículo vacunal con gangliósidos incorporados se obtienen mediante la 35 incorporación hidrofóbica de dichos gangliósidos al complejo de proteínas de la

membrana externa de Neisseria meningitidis.

8. Una composición según la reivindicación 7, donde los gangliósidos que se incorporan hidrofóbicamente al complejo de proteínas de la membrana externa de Neisseria meningitidis son GM1, GM3 o sus variantes N-glicoliladas.

9. Una composición según la reivindicación 1, donde el adyuvante es de naturaleza oleosa o es un polipéptido natural o recombinante.

10. Una composición según la reivindicación 9, donde el adyuvante de naturaleza oleosa es el Adyuvante Incompleto de Freund.

11. Una composición según la reivindicación 10, donde el Adyuvante Incompleto de Freund empleado es Montanide ISA 51.

12. Una composición según la reivindicación 9, donde el adyuvante polipeptídico es una citoquina o una quimioquina.

13. Una composición según reivindicación 12, donde la citoquina es el factor de estimulación de colonias de granulocitos y macrófagos.

14. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para la prevención y tratamiento del cáncer, particularmente cáncer de próstata, colon, pulmón, mama, ovario, cabeza-cuello, vulva, vejiga, cerebro, gliomas, así como de enfermedades crónicas no trasmisibles.

15. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para la prevención y tratamiento de enfermedades infecciosas de origen viral y bacteriano.

16. Una composición según la reivindicación 14, para el tratamiento del Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida,

17. Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, para la fabricación de un medicamento para la prevención y el tratamiento del cáncer, particularmente cáncer de próstata, colon, pulmón, mama, ovario, cabeza-cuello,

vulva, vejiga, cerebro, gliomas, así como de enfermedades crónicas no trasmisibles.

18. Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16,

para la fabricación de un medicamento para la prevención y el tratamiento de 5 enfermedades infecciosas de origen viral y bacteriano.

19. Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades autoinmunes.

20. Uso de Proteoliposomas de Muy Pequeño Tamaño (VSSP) obtenidos a partir de la asociación del Complejo Proteico de la Membrana Externa (OMPC) de la cepa bacteriana Gram-negativa Neisseria meningitidis con gangliósidos incorporados en ellos, para la fabricación de un medicamento para uso en un tratamiento para

15 restaurar la inmunidad en pacientes inmunosuprimidos.

21. Uso según la reivindicación 20, donde los proteoliposomas con los gangliósidos incorporados en ellos se obtienen mediante incorporación hidrófoba de dichos gangliósidos en el Complejo Proteico de la Membrana Externa de Neisseria

20 meningitidis.

22. El uso según la reivindicación 21, donde los gangliósidos que se incorporan hidrófobamente en el Complejo Proteico de la Membrana Externa de Neisseria meningitidis son GM1, GM3 o sus variaciones N-glicosiladas.