COMPOSICIÓN PARA LA TRANSFECCIÓN DE OLIGONUCLEÓTIDOS ACTIVOS PARA LA INACTIVACIÓN DE GENES Y SUS APLICACIONES BIOLÓGICAS Y TERAPÉUTICAS.

Composiciones de transfección que comprenden un oligonucleótido activo para la inactivación de genes y una molécula catiónica anfífila de fórmula (I) en la que - X es N-R1,

S u O, siendo R1 un radical alquilo C1-C4 o un radical alquilo C3-C6 hidroxilado, - R2 y R3, iguales o diferentes, representan H o un radical alquilo C1-C4, o R2 y R3 están enlazados juntos para formar un anillo saturado o insaturado o un heterociclo que tiene 5 ó 6 elementos, - E es un espaciador alquilo C1-C5, - R4 y R5, iguales o diferentes, representan cadenas hidrocarbonadas o fluorocarbonadas de C10-C36 lineales o ramificadas, saturadas o insaturadas, que comprenden opcionalmente cicloalquilo C3-C6, - A ‾ es un anión biocompatible

La invención se refiere a medios, composiciones y métodos in vitro, para el suministro de oligonucleótidos, particularmente ARN interferente pequeño (designado como ARNip en lo sucesivo) que conduce a interferencia por ARN (iARN), a células eucariotas en cultivo, ex vivo o in vivo.

La interferencia por ARN (iARN) es una potente tecnología para inactivar genes a nivel del ARNm (Fire, 1999) (Tuschl et al., 1999), que proporciona degradación de ARNm específica de secuencia e inhibición de la producción de proteínas (Yang et al., 2000) (Zamore et al., 2000) (Hammond et al., 2000) (Parrish et al., 2000). La iARN es un proceso bioquímico altamente eficaz debido a un diseño predecible de secuencias activas de ARNbc corto y a la fijación como objetivo de ARNm específico. Cuando se introduce en el citoplasma de células mediante transfección con un vector de suministro, el ARNip ha demostrado inactivar eficazmente genes exógenos o endógenos en diversas células de mamífero (Elbashir et al., 2001).

Los ARN interferentes pequeños son ARN bicatenarios cortos (ARNbc) que tienen una longitud que varía preferiblemente entre 19 y 29 nucleótidos (véase las patentes WO 0244321, WO 01/075164 A3, EP20010985833, y referencias (Siolas et al., 2005) (Kim et al., 2005)), particularmente 19-23 nucleótidos, y tienen actividad de iARN en sistemas de cultivo celular de mamíferos (Parrish et al., 2000) (Elbashir et al., 2001) (Tuschl, 2001). Los ARNbc cortos, cuando emparejan sus bases, con extremos salientes 3' no emparejados, actúan como guía para la degradación de ARNm específica de secuencia. Los ARNbc cortos más eficaces estaban compuestos por dos cadenas de 21 nucleótidos de longitud que se emparejaron de modo que salientes 3' de 1-3, particularmente de 2, nucleótidos están presentes en ambos extremos del ARNbc (Elbashir et al., 2001).

El éxito de la iARN depende tanto de la longitud, secuencia y estructura química del ARNbc como del sistema de suministro a las células. En comparación con tecnología antisentido o de ribozimas, la estructura secundaria del ARNm objetivo no es un potente factor limitante para la inhibición de la expresión génica con ARNip. Muchas secuencias de ARNip pueden ser eficaces para un ARNm objetivo dado. Por lo tanto, la estabilidad y biodisponibilidad de ARNip bicatenarios así como la cantidad de ARNbc suministrado a las células, y particularmente en el citoplasma, siguen siendo los factores limitantes para una inactivación eficaz, en lugar de la accesibilidad al objetivo por parte del ARNip.

Muchos sistemas de suministro son útiles para introducir oligonucleótidos en células. Actualmente, vectores no virales basados en transfección mediada por lípidos catiónicos, tales como Oligofectamin, TRANSIT-TKO, LipofectAmine2000, SiGuide, RNAiFect, HiperFect, o jetSi, se comercializan para el suministro de ARNip. Al contrario que los sistemas a base de polímeros catiónicos, los lípidos catiónicos demostraron liberar el ácido nucleico en el citoplasma después de la rotura endosómica temprana y la formación de complejo con fosfatidilserina (Zelphati y Szoka, 1996).

El sistema de vector no viral comprende ventajosamente reactivos de suministro a base de lípidos o polímeros o péptidos catiónicos. El sistema de vector no viral es una formulación que comprende al menos un reactivo de suministro y componentes adicionales para estabilizar la formulación, fijar como objetivo células, tejidos u órganos, o aumentar la eficacia de transfección.

La presente invención describe una nueva clase de agentes de transfección no virales, que pertenecen al grupo de los lípidos catiónicos, que están particularmente adaptados para la transfección de oligonucleótidos de pequeño tamaño. Especialmente la interacción específica de pequeñas moléculas con oligonucleótidos impulsó a los inventores a diseñar una nueva clase de agentes de transfección.

Muchas moléculas se unen a oligonucleótidos bicatenarios (ONbc). Éstas pueden dividirse en tres clases con respecto a sus modos de unión:

1) intercalación entre pares de bases apilados como se ejemplifica mediante quinacrina o bromuro de etidio;

2) interacciones electrostáticas y por puentes de hidrógeno con heteroátomos de la cadena principal del oligonucleótido según se observó para las poliaminas espermina o espermidina,

3) Compuestos de unión al Surco Menor (MGB): estructuras heterocíclicas extendidas que llenan el profundo surco menor del ADN e interactúan principalmente mediante interacciones de Van der Waals y puentes de hidrógeno. Dichas moléculas oligo-heterocíclicas se ejemplifican mejor mediante el antibiótico netropsina (oligopéptido que contiene N-metilpirrol) y su análogo distamicina A (Cho y Rando, 2000).

Las hélices de ribonucleótidos muestran algunas características distintas: aunque la intercalación sigue siendo posible, los modos de unión por interacciones de Van der Waals y electrostáticas se producen preferentemente en el profundo y algunas veces poco profundo surco mayor.

En particular, los compuestos de unión de tri-imidazol tales como AR-1-144, diseñados como análogos de netropsina que contienen imidazol (Yang et al., 1999), atrajeron la atención de los inventores. En este caso, el grupo amino N2 de guanina forma un puente de hidrógeno bifurcado con un par Im/Im lado a lado (Yang et al., 1999). El resto de la molécula parece tener más interacciones hidrófobas en el surco menor, como se muestra mediante la molécula parental distamicina A (Yang et al., 1999).

El colorante de bisbencimidazol Hoechst33258 es un compuesto de unión al surco menor igualmente conocido y muestra selectividad por secuencias de ADN ricas en AT. También se une a ARN en regiones “hinchadas”, donde encaja en un bolsillo formado por pares de bases sucesivos, como en ARN TAR (Dassonneville et al., 1997).

Los inventores han descubierto que la eficacia de transfección podía obtenerse combinando un oligonucleótido de interés con moléculas catiónicas anfífilas específicas formuladas de forma estable como liposomas de pequeño tamaño con co-lípidos neutros.

Es, entonces, un objeto de la invención proporcionar nuevas moléculas útiles como agentes de transfección.

20 [0014] Es otro objeto de la invención proporcionar composiciones de estas moléculas útiles para transfección.

Es otro objeto proporcionar una ruta sintética y un método de purificación eficaz para dichas moléculas anfífilas.

25 [0016] De acuerdo con otro objeto más, la invención se refiere a un método para transfectar células en cultivo.

La invención también se refiere a composiciones para su uso como composiciones farmacéuticas para inducir un efecto regulador sobre la expresión de una o más proteínas objetivo responsables de o implicadas en enfermedades genéticas.

De acuerdo con la invención, las nuevas moléculas útiles como agentes para composiciones de transfección de oligonucleótidos, más particularmente, para interferencia por ARN, comprenden un resto catiónico capaz de unirse a oligonucleótidos unidos a un resto lipófilo que permite a la molécula atravesar la bicapa lipídica de las membranas celulares.

**(Ver fórmula)**

en la que: 40

- X es N-R1, S u O, siendo R1 un radical alquilo C1-C4 o un radical alquilo C3-C6 hidroxilado,

- R2 y R3, iguales o diferentes, representan H o un radical alquilo C1-C4, o R2 y R3 están enlazados

conjuntamente para formar un anillo saturado o insaturado o un heterociclo que tiene 5 ó 6 elementos, 45

- E es un espaciador alquilo C1-C5,

- R4 y R5, iguales o diferentes, representan cadenas hidrocarbonadas o fluorocarbonadas de C10-C36,

lineales o ramificadas, saturadas o insaturadas, comprendiendo opcionalmente dichas cadenas cicloalquilo 50 C3-C6,

- A- es un anión biocompatible.

Los heterociclos formados cuando R2 y R3 están enlazados conjuntamente son insaturados o saturados y 55 tienen 5 ó 6 elementos y comprenden heteroátomos de C y N, S u O.

De acuerdo con una realización preferida de la invención, R4 y R5 en la fórmula (I) son radicales hidrocarburo de C14-C36 y E es un espaciador alquilo C1-C4.

En un grupo preferido, R4 y R5 son iguales.

En moléculas ventajosas,... [Seguir leyendo]

1. Composiciones de transfección que comprenden un oligonucleótido activo para la inactivación de genes y una

5 en la que

- X es N-R1, S u O, siendo R1 un radical alquilo C1-C4 o un radical alquilo C3-C6 hidroxilado, -R2 y R3, iguales o diferentes, representan H o un radical alquilo C1-C4, o R2 y R3 están enlazados juntos para formar un anillo saturado o insaturado o un heterociclo que tiene 5 ó 6 elementos,

- E es un espaciador alquilo C1-C5, 15 -R4 y R5, iguales o diferentes, representan cadenas hidrocarbonadas o fluorocarbonadas de C10-C36 lineales

o ramificadas, saturadas o insaturadas, que comprenden opcionalmente cicloalquilo C3-C6,

- A- es un anión biocompatible.

2. Las composiciones de la reivindicación 1, en las que dicho heterociclo formado cuando R2 y R3 se enlazan juntos, es insaturado o saturado y tiene 5 ó 6 elementos y comprende C y N, S u O como heteroátomos.

3. Las composiciones de la reivindicación 1 ó 2, en las que R4 y R5 son cadenas hidrocarbonadas de C14-C36 y E

es un espaciador alquilo C1-C4. 25

4. Las composiciones de la reivindicación 3, en las que R4 y R5 son iguales.

5. Las composiciones de la reivindicación 3, en las que R4 y R5 son radicales alquilo C18 y E es alquilo C1.

30 6. Las composiciones de la reivindicación 3, en las que R4 y R5 son radicales alquilo C16 y E es alquilo C4.

7. Las composiciones de la reivindicación 3, en las que R4 y R5 son diferentes.

8. Las composiciones de la reivindicación 7, en las que R4 y R5 con cadenas alquilo C18 y C17, y E es un alquilo 35 C2.

9. Las composiciones de la reivindicación 7, en las que R4 y R5 son radicales alquilo C32 y C18, respectivamente, y E es alquilo C1.

40 10. Las composiciones de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 9, en las que R2 y R3 son H o están enlazados juntos para formar un anillo aromático.

11. Las composiciones de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en las que X es N-R1, siendo

R1 CH3. 45

12. Las composiciones de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en las que X es S u O.

13. Las composiciones de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en las que A-es Cl-u OH-.

50 14. Las composiciones de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, formuladas con un co-lípido neutro.

15. Las composiciones de la reivindicación 14, en las que el co-lípido es un derivado de fosfatidiletanolamina tal como dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), o colesterol.

16. Las composiciones de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en las que dicho oligonucleótido es activo para interferencia por ARN.

5 17. Las composiciones de la reivindicación 16, en las que dicho oligonucleótido es un ARNip.

18. Las composiciones de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en las que dicho oligonucleótido o ARNip, respectivamente, comprende grupos para su estabilización contra la degradación, seleccionándose dicho grupo entre el grupo que comprende nucleótidos de purina, nucleótidos de pirimidina sustituidos con análogos modificados tales como desoxinucleótidos, y/o análogos de nucleótidos modificados tales como ribonucleótidos

o desoxirribonucleótidos modificados en el azúcar o en la cadena principal.

19. Las composiciones de acuerdo con la reivindicación 17 ó 18, en las que dicho oligonucleótido o ARNip,

respectivamente, contiene desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos o análogos de nucleótidos, tales como 15 metilfosfonato, morfolinfósforodiamidato, fósforotioato, APN, ANB, análogos de nucleótidos 2' alquilo.

20. Un método para transfección in vitro o ex vivo de células vivas que comprende introducir en las células una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19.

21. El método de la reivindicación 20, que comprende usar concentraciones nanomolares y hasta picomolares de ARNip o de oligonucleótidos para mediar en la inactivación de genes.

22. El método de la reivindicación 20 ó 21, para cultivo celular, para células tanto adherentes como no adherentes,

para genómica funcional, validación de objetivos y aplicaciones terapéuticas. 25

23. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, que usa protocolos de transfección aplicados en presencia de suero.

24. El método de la reivindicación 20 ó 21, para mediar en aplicaciones de HTS cuando se realiza un procedimiento de transfección inversa.

25. Las composiciones de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, para su uso como fármacos.

26. Las composiciones de acuerdo con la reivindicación 25, en una forma adecuada para una administración por vía

35 oral, sistémica o tópica, en las que dichas composiciones están asociadas a un vehículo inerte farmacéuticamente aceptable.

27. Las composiciones de acuerdo con la reivindicación 25 ó 26, para inducir un efecto regulador sobre la expresión de una o más proteínas objetivo responsables de o implicadas en enfermedades genéticas hereditarias o enfermedades genéticas complejas.

28. Las composiciones de la reivindicación 27, para el tratamiento de cáncer, infecciones víricas o infecciones parasitarias.

45 29. Un método para la síntesis de una molécula catiónica anfífila de fórmula (I) de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, que comprende

- elaborar una cadena larga ramificada, cuya parte hidrocarbonada se obtiene mediante métodos de acoplamiento C-C convencionales, tal como se ilustra mediante la reacción de acoplamiento de Grignard a ésteres o aldehídos. La parte hidrófoba sintetizada contiene un alcohol primario o secundario como se ilustra en la fórmula IV:

HO-E-R4(R5) (IV)

55 - activar la función alcohol mediante conversión en un derivado de metanosulfonilo, de fórmula (V) MsO-E-R4 (R5) y/o otros derivados activados convencionales tales como derivados de halógeno

- hacer reaccionar a dichos derivados activados, en particular derivados de metanosulfonilo, con un heterociclo de fórmula (VI)

**(Ver fórmula)**

en la que X es N-R1, S u O en condiciones especificadas para obtener (I)

**(Ver fórmula)**

30. El método de la reivindicación 29, que comprende además la purificación y conversión en derivados salinos de moléculas anfífilas de fórmula (I) en una forma neutra, mediante precipitación selectiva en metanol/agua/ácido a partir del medio de reacción.