Una molécula de ácido nucleico quimérico infecciosa de circovirus porcino (PCV1-2) caracterizada por tener una molécula de ácido nucleico que codifica un PCV1 infeccioso,

no patógeno que contiene un gen del marco abierto de lectura 2 inmunógeno (ORF2) de un PCV2 patógeno en lugar de un gen de ORF2 de la molécula de ácido nucleico de PCV1

Clones de ADN infecciosos quiméricos de circovirus porcino y sus usos.

Campo de la invención

La presente invención es en el campo de clones de ADN de circovirus porcino infeccioso tipo-1 (PCV1) y tipo-2 (PCV2), y se refiere a clones de ADN infecciosos PCV1-2 quiméricos y virus quiméricos vivos derivados de clones de ADN quiméricos, útiles como vacunas.

Descripción de la técnica relacionada

Circovirus porcino (PCV) se aisló originalmente como un contaminante de cultivo de células de una línea celular de riñón porcina PK-15 (1. Tischer et al., "A very small porcine virus with circular single-stranded DNA", Nature 295: 64-66 (1982); 1. Tischer et al., "Characterization of papovavirus and picornavirus-like particles in permanent pig kidney cell lines", Zentralbl. Bakteriol. Hyg. Otg. A. 226 (2): 153-167 (1974)). PCV es un pequeño virus icosahédrico sin envuelta que contiene un genoma de ADN circular de una sola cadena de aproximadamente 1,76 kb. PCV está clasificado en la familia de Circoviridae, que consiste en otros tres circovirus de animales diferentes (virus de anemia de pollo (CAV), virus de enfermedad de pico y pluma de Psittacine (PBFDV) y el circovirus de colúmbidos recientemente descubierto (CoCV) de palomas) y tres circovirus de plantas (virus del cogollo racimoso de banano, virus de podredumbre foliar del cocotero y virus de malformación del trébol subterráneo) (M. R. Bassami et al., "Psittacine beak and feather disease virus nucleotide sequence analysis and its relationship to porcine circovirus, plant circoviruses, and chicken anemia virus", Virology 249: 453-459 (1998); J. Mankertz et al., "Transcription analysis of porcine circovirus (PCV)", Virus Genes 16: 267-276 (1998); A. Mankertz et al., "Cloning and sequencing of columbid circovirus (CoCV), a new circovirus from pigeons", Arch. Virol. 145: 2469-2479 (2000); B. M. Meehan et al., "Sequence of porcine circovirus DNA: affinities with plant circoviruses", J. Gen. Virol. 78: 221-227 (1997); B. M. Meehan et al., "Characterization of novel circovirus DNAs associated with wasting syndromes in pigs", J. Gen. Virol. 79: 2171-2179 (1998); D. Todd et al., "Comparison of three animal viruses with circular single-stranded DNA genomes", Arch. Virol. 117: 129-135 (1991)). Miembros de los tres circovirus animales reconocidos previamente (PCV, CAV, y PBFDV) no comparten la homología de secuencias de nucleótidos o determinantes antigénicos entre sí (M. R. Bassami et al., 1998, supra; D. Todd et al., 1991, supra). El genoma del CoCV recientemente identificado compartía aproximadamente el 40% identidad de secuencia de nucleótidos con la de PCV (A. Mankertz et al., "Cloning and sequencing of columbid circovirus (CoCV), a new circovirus from pigeons", Arch. Virol. 145: 2469-2479 (2000)). Recientemente, un circovirus humano novedosos con un genoma circular, denominado virus transmitido por transfusión o TT virus (TTV), se identificó de individuos asociado a hepatitis después de transfusión (H. Miyata et al., "Identification of a novel GC-rich 113-nucleotide region to complete the circular, single-stranded DNA genome of TT virus, the first human circovirus", J. Virol. 73: 3582-3586 (1999); T. Nishizawa et al., "A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of unknown etiology", Biochem. Biophys. Res. Commun. 241: 92-97 (1997)). De manera adicional, un minivirus humano de tipo TTV (TLMV) se identificó a partir de sangre de donantes normales (P. Biagini et al., "Genetic analysis of full-Iength genomes and subgenomic sequences of TT virus-like mini virus human isolates", J. Gen. Virol. 82: 379-383 (2001); K. Takahashi et al., "Identification of a new human DNA virus (TTV-like mini virus, TLMV) intermediately related to TT virus and chicken anemia virus", Arch. Virol. 145: 979-93 (2000)) y un terver circovirus humano novedoso, conocido como virus SEN (SENV), también se descubrió de seres humanos con hepatitis después de transfusión (T. Umemura et al., "SEN virus infection and its relationship to transfusion-associated hepatitis", Hepathology 33: 1303-1311 (2001)). La organización genómica de tanto TTV como_TLMV humanos es similar al de CAV (P. Biagini et al., 2001, supra; H. Miyata et al., 1999, supra; K. Takahashi et al., 2000, supra). Aunque se encontraron anticuerpos para PCV en diversas especies animales incluyendo seres humanos, ratones, ganado y cerdos (G. M. Allan et al., "production preliminary characterization and applications of monoclonal antibodies to porcine circovirus", Vet. Immunol. Immunopathol. 43:357-371 (1994); G. C. Dulac and A. Afshar, "Porcine circovirus antigens in PK-15 cell line (ATCC CCL-33) and evidence of antibodies to circovirus in Canadian pigs", Can. J. Vet. Res. 53: 431-433 (1989); S. Edwards and J. J. Sands, "Evidence of circovirus infection in British pigs", Vet. Rec. 134: 680-1 (1994); J. C. Harding and E.G. Clark, "Recognizing and diagnosing postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS)", Swine Health and Production 5: 201-203 (1997); R. K. Hines and P. D. Lukert, "Porcine circovirus: a serological survey of swine in the United States", Swine Health and Production 3: 71-73 (1995); G. P. Nayar et al., "Evidence for circovirus in cattle with respiratory disease and from aborted bovine fetuses", Can. Vet. J. 40: 277-278 (1999); I. Tischer et al., "Distribution of antibodies to porcine circovirus in swine populations of different breeding farms", Arch. Virol. 140: 737-743 (1995); I. Tischer et al., "Presence of antibodies reacting with porcine circovirus in sera of humans, mice, and cattle", Arch. Virol. 140: 1427-1439 (1995)), se conoce poco con relación a la patogénesis de PCV en estas especies animales. La infección experimental de cerdos con PCV derivado de células PK-15 no produjo enfermedad clínica y de este modo, este virus no se considera que sea patogénico para los cerdos (G. M. Allan et al., "Pathogenesis of porcine circovirus; experimental infections of colostrum deprived piglets and examination of pig foetal material", Vet. Microbiol. 44: 49-64 (1995); I. Tischer et al., "Studies on epidemiology and pathogenicity of porcine circovirus", Arch. Virol. 91: 271-276 (1986)). El PCV no patogénico derivado de la línea celular PK-15 contaminada se denominó circovirus porcino tipo 1 o PCV1.

Síndrome de adelgazamiento multisistémico post-destete (PMWS), se descubrió primero en 1991 (J. C. Harding and E.G. Clark, 1997, supra), es una enfermedad compleja de lechones de destete que está cada vez más extendida. Con la amenaza de un impacto económico serio potencial para la industria del cerdo, se hace urgente desarrollar una vacuna contra PCV2, el agente causante principal de PMWS. PMWS afecta directamente a cerdos entre 5-18 semanas de edad. Los signos clínicos de PMWS incluyen pérdida de peso progresiva, disnea, taquipnea, anemia, diarrea, e ictericia. La tasa de mortalidad puede variar entre 1% y 2%, y hasta 40% en algunos casos complicados en el Reino Unido. (M. Muirhead, "Sources of information on PMWS/PDNS", Vet. Rec. 150: 456 (2002)). Las lesiones microscópicas características de PMWS incluyen neumonía intersticial granulomatosa, linfadenopatía, hepatitis, y nefritis (G. M. Allan y J. A. Ellis, "Porcine circoviruses: a review", J. Vet. Diagn. Invest. 12: 3-14 (2000); J. C. Harding and E.G. Clark, 1997, supra). Se han localizado rastros de PMWS en cerdos en Canadá, Estados Unidos (G. M. Allan et al., "Novel porcine circoviruses from pigs with wasting disease syndromes", Vet. Rec. 142: 467-468 (1998); G. M. Allan et al., "Isolation of porcine circovirus-like viruses from pigs with a wasting disease in the USA and Europe", J. Vet. Diagn. Invest. 10: 3-10 (1998); G. M. Allan and J. A. Ellis, 2000, supra; J. Ellis et al., "Isolation of circovirus from lesions of pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome", Can. Vet. J. 39: 44-51 (1998); A. L. Hamel et al., "Nucleotide sequence of porcine circovirus associated with postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs", J. Virol. 72: 5262-5267 (1998); M. Kiupel et al., "Circovirus-like viral associated disease in weaned pigs in Indiana", Vet. Pathol. 35: 303-307 (1998); R. Larochelle et al., "Identification and incidence of porcine circovirus in routine field cases in Quebec as determined by PCR", Vet. Rec. 145: 140-142 (1999); B. M. Meehan et al., 1998, supra; I. Morozov et al., "Detection of a novel strain of porcine circovirus in pigs...

1. Una molécula de ácido nucleico quimérico infecciosa de circovirus porcino (PCV1-2) caracterizada por tener una molécula de ácido nucleico que codifica un PCV1 infeccioso, no patógeno que contiene un gen del marco abierto de lectura 2 inmunógeno (ORF2) de un PCV2 patógeno en lugar de un gen de ORF2 de la molécula de ácido nucleico de PCV1.

2. La molécula de ácido nucleico quimérico de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico quimérico tiene una secuencia de nucleótidos establecida en la figura 9, su hebra complementaria o secuencia de nucleótidos que tiene al menos 95% de homología con la secuencia de nucleótidos de la figura 9.

3. Un plásmido biológicamente funcional o vector viral caracterizado por contener la molécula de ácido nucleico quimérico de acuerdo con la reivindicación 2.

4. El plásmido de acuerdo con la reivindicación 3 caracterizado por tener la Designación de Depósito de Patente de ATCC PTA-3912.

5. Una célula huésped adecuada transfectada por un vector caracterizada por comprender la molécula de ácido nucleico quimérico de acuerdo con la reivindicación 2.

6. Un circovirus porcino no virulento, infeccioso quimérico caracterizado por ser producido por las células que contienen la molécula de ácido nucleico quimérico de acuerdo con la reivindicación 2.

7. El circovirus porcino infeccioso quimérico de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque dichas células contienen el plásmido que tiene Designación de Depósito de Patente de ATCC PTA-3912.

8. Un procedimiento para la producción de un producto de polipéptido inmunogénico, dicho procedimiento caracterizado por comprender: desarrollo, en condiciones de nutrientes adecuadas, células huésped procarióticas y eucarióticas transfectadas con una molécula de ácido nucleico quimérico de acuerdo con la reivindicación 2 de una manera que permita la expresión de dicho producto de polipéptido, y aislamiento del producto de polipéptido deseado de la expresión de dicha molécula de ácido nucleico.

9. Una vacuna viral que protege a un cerdo contra infección viral o Síndrome de adelgazamiento multisistémico post-destete (PMWS) provocado por PCV2 caracterizada por comprender un vehículo, no tóxico fisiológicamente aceptable y una cantidad inmunogénica de un miembro seleccionado entre el grupo que consiste en:

(a) una molécula de ácido nucleico quimérico que tiene una secuencia de nucleótidos establecida en la figura 9, su hebra complementaria o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 95% de homología con la secuencia de nucleótidos de la figura 9;

(b) un plásmido biológicamente funcional o vector viral que contiene una molécula de ácido nucleico quimérico, la hebra complementaria o la secuencia de nucleótidos de la que tiene al menos 95% de homología con la secuencia de nucleótidos de la figura 9; y

(c) un circovirus porcino infeccioso quimérico no virulento hecho a partir de una molécula de ácido nucleico quimérico de PCV1-2, en el que el gen de la cápsida de ORF2 de PCV1 se reemplaza con el gen de la cápsida de ORF2 de PCV2.

10. La vacuna viral de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizada porque dicha vacuna contiene el circovirus porcino quimérico.

11. La vacuna viral de acuerdo con la reivindicación 9 o reivindicación 10, que comprende además una cantidad inmunogénica de al menos un antígeno porcino adicional.

12. La vacuna viral de acuerdo con la reivindicación 11, en la que al menos un antígeno porcino adicional se selecciona entre el grupo que consiste en virus de síndrome porcino reproductor y respiratorio (PRRSV) y parvovirus porcino (PPV).

13. La vacuna viral de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 9 a 12 para su uso en la protección de un cerdo contra infección viral o síndrome de adelgazamiento multisistémico post-destete (PMWS) provocado por PVC2.

14. Uso de la vacuna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 en la fabricación de un medicamento para la protección de un cerdo contra infección viral o síndrome de adelgazamiento multisistémico post-destete (PMWS) provocado por PVC2.

15. El uso de acuerdo con la reivindicación 14, caracterizado por comprender la administración de la vacuna al cerdo.

16. El uso de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizado por comprender la administración de la vacuna por vía parenteral, intranasal, intradérmica o transdérmica al cerdo.

17. El uso de acuerdo con la reivindicación 16, caracterizado por comprender la administración de la vacuna por vía intralinfoide o intramuscular al cerdo.

18. Un procedimiento de preparación de la molécula de ácido nucleico quimérico infeccioso de PCV1-2 de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por eliminar un gen del marco abierto de lectura 2 (ORF2) de una molécula de ácido nucleico que codifica un PCV1 infeccioso, no patógeno; reemplazando la posición del gen de ORF2 del PCV1 con un gen de ORF2 inmunogénico de un PCV2 patógeno; y recuperación de la molécula de ácido nucleico quimérico.

19. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 18, caracterizado porque dicho gen de ORF2 de PCV2 se obtiene a partir de la molécula de ácido nucleico molecular de PCV2 contenida en un vector de expresión que tiene la Designación de Depósito de Patente de ATCC PTA3913.

20. Una molécula de ácido nucleico quimérico infeccioso recíproco de PCV2-1 caracterizada por comprender una molécula de ácido nucleico que codifica un PCV2 infeccioso, patógeno que tiene un gen de ORF2 inmunogénico de un PCV1 no patógeno en lugar de un gen de ORF2 de la molécula de ácido nucleico de PCV2.