CEPAS PROBIÓTICAS DE LACTOBACILLUS SALIVARIUS Y AGENTES ANTIMICROBIANOS OBTENIDOS A PARTIR DE LAS MISMAS.

Un cultivo biológicamente puro de una cepa de Lactobacillus salivarius aislada de tracto gastrointestinal humano resecado y lavado y que es adherente para el mismo,

que inhibe una amplia variedad de microorganismos Gram positivos y Gram negativos y que secreta un producto que tiene actividad antimicrobiana a un sobrenadante exento de células, actividad que es producida sólo por células en crecimiento y que es destruida por proteinasa K y pronasa E, cepa cuyas propiedades inhibitorias y productos secretores se mantienen en presencia de concentraciones fisiológicas de bilis humana y jugo gástrico humano, cepa que presenta un amplio espectro de actividad sobre bacterias, incluyendo Listeria, Staphylococcus y Bacillus, pero que no inhibe a muchos lactobacilos íntimamente relacionados

Campo del invento

Este invento se refiere a cepas bacterianas probióticas capaces de producir agentes antimicrobianos que tienen diversas aplicaciones en productos alimenticios y en medicina. Más particularmente, el invento se refiere a cepas probióticas de Lactobacillus salivarius y a un agente antibacteriano peptídico derivado de ellas, con propiedades de tipo bacteriocina.

Técnica fundamental

En la última década se ha llevado a cabo mucha investigación en el campo de los probióticos humanos [véase la revisión de Huis in't Veld et al. (1994), Tibtech 12, 6-8]. Esta investigación ha sido impulsada por el creciente interés del público por su salud y bienestar. Muchos productos probióticos están ahora disponibles en el mercado y algunos de los efectos beneficiosos derivados de estos productos van desde el alivio de la intolerancia a la lactosa [S.

E. Gilliland (1990), FEMS Microbiol. Rev. 87, 175-188] hasta la prevención de enfermedades diarreicas [P. Marteau et al. (1993), FEMS Microbiol. Rev. 12, 207-220] y la posible prevención de la carcinogénesis [S. Adachi (1992) en "The Lactic Acid Bacteria in Health and Disease" (redactado por Wood), 233-262, Elsevier, Barking]. Existe una controversia acerca de muchos de estos efectos beneficiosos ya que no se dispone de procedimientos normalizados y se han publicado resultados contradictorios en relación con los posibles efectos beneficiosos de productos cultivados que contienen bacterias "probióticas".

Se ha citado una mala elección de cepa como uno de los factores que contribuyen a la inconsistencia y la variabilidad de los resultados [P. Marteau et al. (1993), supra; H. S. Kim (1988), Cult. Dairy Prod. J. 23, 6-9], y R. Fuller (1989, J. Appl. Bact. 66, 365-378) esbozó unos criterios relativos al aislamiento exitoso de cepas probióticas. Las cepas debían ser nativas para la supuesta especie huésped y tener además la capacidad de (i) sobrevivir y crecer dentro de ese huésped, (ii) ejercer un efecto beneficioso en el sitio diana y (iii) poderse mantener en sistema o alimento vehicular a lo largo de la fabricación y almacenamiento del producto.

Hay un mercado para productos que promueven la salud, incluyendo probióticos, que crece rápidamente. Muchos de dichos productos son ahora asequibles [S. C. Jong y J. M. Birmingham (1993), ATCC Quart. Newslett. 13 (1): 1-11]. Uno de los componentes más importantes de estos productos son los microorganismos usados. Las especies más frecuentemente utilizadas incluyen Bifidobacterium sp., Lactobacillus sp. y Propionibacterium sp. [M. G. O'Sullivan et al (1992), Trends in Food Sci. and Tech. 3 (12), 309-314]. Hay una falta de evidencia sustanciada, procedente de pruebas controladas, de que los organismos actualmente usados en dichos productos sean aquellos que ejercen efectos beneficiosos sobre la flora intestinal [G. W. Tannock (1983) en "Human Intestinal Microflora in Health and Disease", 517-539, redactado por D. J. Hentges, New York, Academic Press]. La fuente del microorganismo es crítica para su supervivencia y, por lo tanto, su función en el tracto intestinal humano. Y. K. Lee y S. Salminen (1995, Trends Food Sci. Technol. 6, 241-245) afirmaron que, como requisito general, una cepa probiótica debería ser de origen humano ya que algunos efectos promotores de la salud pueden ser dependientes de la especie. Es bien sabido que la microflora nativa es uno de los mecanismos de defensa principales que protegen al ser humano de la colonización por bacterias invasoras alóctonas [C. Tancrede (1992), Eur. J. Clin. Microbiol. Infec. Dis. 11 (11), 1012-1015] y es además el mejor aliado del ser humano cuando apoya al sistema inmune. Las poblaciones bacterianas de los diferentes niveles del tracto gastrointestinal constituyen ecosistemas complejos que dependen de la fisiología del huésped y de las interacciones entre bacterias.

Ten Brink et al. (1994, Journal of Applied Bacteriology 77, 140-148) aislaron y exploraron un gran número (~1000) de cepas de Lactobacillus en cuanto a la producción de actividad antimicrobiana. Se aislaron lactobacilos de diversos forrajes y alimentos (col fermentada, queso, salchicha y ensilaje) fermentados, placa dental humana, y heces procedentes de diferentes animales de laboratorio (rata, ratón, cobayo y codorniz) y seres humanos voluntarios. Sólo se hallaron ocho cepas positivas, y se estudiaron dos de éstas, a saber, Lactobacillus salivarius M7 y Lactobacillus acidophilus M46. La primera cepa produce salivaricina B, una bacteriocina de amplio espectro que inhibe el crecimiento de Listeria monocytogenes, Bacillus cereus, Brochothrys thermosphacta, Enterococcus faecalis y muchos lactobacilos. El L. acidophilus M46 produce acidocina B, una bacteriocina que combina la inhibición de Clostridium sporogenes con un espectro de actividad muy estrecho dentro del género Lactobacillus. Sin embargo, estas cepas no son nativas con respecto a la especie huésped infectada, que es uno de los criterios que son necesarios para una cepa probiótica exitosa para uso humano.

K. Arihara et al. (1996, Letters in Applied Microbiology 22, 420-424) han aislado salivacina 140, una bacteriocina de Lactobacillus salivarius subsp. salicinius T140. La cepa T140 se aisló de la superficie de hojas de carrizo de la Pampa procedente de Japón, desarrolladas cerca de un establo, y, por consiguiente, era probable que la cepa hubiera procedido de heces animales.

Existe la necesidad de cepas probióticas que satisfagan los criterios anteriormente mencionados. Se cree que la producción de bacteriocinas por lactobacilos desempeña un papel importante en la exclusión competitiva de patógenos y otros microorganismos indeseables del tracto intestinal de los seres humanos. Las bacteriocinas son definidas en términos generales como compuestos proteicos que ejercen un efecto bactericida sobre una gran variedad de microorganismos.

Debido a su diversidad de especies y hábitats, los lactobacilos son las más bacteriocinogénicas de las bacterias ácido-lácticas (LAB; del inglés, lactic acid bacteria). Se han aislado ahora tantas como 40 bacteriocinas producidas por lactobacilos [T. R. Klaenhammer (1993), FEMS Microbiol. Rev. 12, 39-86].

Se han aislado bacteriocinas de heces de niños. Sin embargo, se halló que las bacteriocinas presentaban estrechas variedades de huéspedes y sólo eran activas sobre otras especies de lactobacilo [T. Toba et al. (1991), Lett. Appl. Microbiol. 12, 228-231].

Existe la necesidad de bacteriocinas con un amplio espectro de actividad.

Descripción del invento

El invento proporciona un cultivo biológicamente puro de una cepa de Lactobacillus salivarius aislada de tracto gastrointestinal humano resecado y lavado y que es adherente para el mismo, que inhibe una amplia variedad de microorganismos Gram positivos y Gram negativos y que secreta un producto que tiene actividad antimicrobiana a un sobrenadante exento de células, actividad que es producida sólo por células en crecimiento y que es destruida por proteinasa K y pronasa E, cepa cuyas propiedades inhibitorias y productos secretores se mantienen en presencia de concentraciones fisiológicas de bilis humana y jugo gástrico humano, cepa que presenta un amplio espectro de actividad sobre bacterias, incluyendo Listeria, Staphylococcus y Bacillus, pero que no inhibe a muchos lactobacilos íntimamente relacionados.

Son dos cepas especialmente preferidas: la cepa UCC 1 de Lactobacillus salivarius [depositada en The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB) el 27 de noviembre de 1996 y a la que se le otorgó el número de acceso NCIMB 40830] y la cepa UCC 118 de Lactobacillus salivarius [depositada el NCIMB el 27 de noviembre de 1996 y a la que se le otorgó el número de acceso NCIMB 40829], y mutantes o variantes de las mismas que tienen las mismas propiedades.

El producto antimicrobiano secretado por las cepas de Lactobacillus salivarius de acuerdo con el invento puede ser el producto de expresión de un plásmido u otro elemento extracromosómico asociado con dichas cepas.

El invento también proporciona un producto promotor de la salud, que contiene como probiótico una cepa de Lactobacillus salivarius como la anteriormente definida.

Las cepas de Lactobacillus salivarius de acuerdo con el invento se aislaron de apéndices y secciones de los intestinos grueso y delgado del tracto gastrointestinal (TGI) humano obtenido durante una cirugía reconstructiva.

Un sitio preferido para el aislamiento... [Seguir leyendo]

1. Un cultivo biológicamente puro de una cepa de Lactobacillus salivarius aislada de tracto gastrointestinal humano resecado y lavado y que es adherente para el mismo, que inhibe una amplia variedad de microorganismos Gram positivos y Gram negativos y que secreta un producto que tiene actividad antimicrobiana a un sobrenadante exento de células, actividad que es producida sólo por células en crecimiento y que es destruida por proteinasa K y pronasa E, cepa cuyas propiedades inhibitorias y productos secretores se mantienen en presencia de concentraciones fisiológicas de bilis humana y jugo gástrico humano, cepa que presenta un amplio espectro de actividad sobre bacterias, incluyendo Listeria, Staphylococcus y Bacillus, pero que no inhibe a muchos lactobacilos íntimamente relacionados.

2. Un cultivo biológicamente puro de la cepa UCC 1 de Lactobacillus salivarius (NCIMB 40830) o de un mutante o variante de la misma que tiene las mismas propiedades.

3. Un cultivo biológicamente puro de la cepa UCC 118 de Lactobacillus salivarius (NCIMB 40829) o de un mutante o variante de la misma que tiene las mismas propiedades.

4. Un producto promotor de la salud, que contiene una cepa de Lactobacillus salivarius de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1-3 como probiótico.

5. Una fracción purificada de un agente antimicrobiano obtenible de una cepa de Lactobacillus salivarius de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1-4, que tiene las propiedades siguientes:

(i) un peso molecular de 5,0 – 5,3 kDa;

(ii) una composición relativa de aminoácidos que tiene más de 45% de aminoácidos hidrófobos, 19-21% de glicocola, 13-14% de alanina y 11-12% de leucina, nada de triptófano ni tirosina, una metionina y cuatro restos de prolina;

(iii) una secuencia de aminoácidos ID. SEC. nº 1 en, o adyacente a, el extremo N; y

(iv) comprende una secuencia de aminoácidos ID. SEC. nº 2.

6. Una fracción purificada de acuerdo con la Reivindicación 5, para uso en productos alimenticios.

7. Una fracción purificada de acuerdo con la Reivindicación 5, para uso como medicamento.

8. Una fracción purificada de acuerdo con la Reivindicación 5, para uso contra S. aureus resistente a meticilina (MRSA).

9. La secuencia de DNA ID. SEC. nº 6 que codifica la bacteriocina ABP118.