Un procedimiento para producir ácidos grasos poliinsaturados con cuatro o más dobles enlaces que comprende la expresión heteróloga de una ruta que requiere oxígeno en un Saccharomyces cerevisiae desarrollado sobre un sustrato de ácido no graso,

en el que la expresión heteróloga comprende la combinación de la expresión heteróloga de secuencias de nucleótidos que codifican delta-12 desaturasa, delta-6 desaturasa, delta-6 elongasa, delta-5 desaturasa y delta-9 desaturasa

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Esta invención se refiere en general a la producción de ácidos grasos y en particular a la producción de ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) en diversas células, de manera más específica, a la expresión de rutas heterólogas en microorganismos para la producción de ácidos grasos y en particular ácidos grasos poliinsaturados.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los PUFA son ácidos grasos poliinsaturados con una cadena larga de hidrocarburos compuesta de 18 o más átomos de carbono que tienen dos o más dobles enlaces y un grupo carboxilato terminal.

Las propiedades de los ácidos grasos poliinsaturados están altamente influenciadas por la posición del doble enlace, y se diferencia de los PUFA omega-3, en que el primer doble enlace en la tercera posición contando desde el extremo metilo de la cadena de carbono, y los PUFA omega-6, que tienen en primer doble enlace en la sexta posición contando desde el extremo metilo de la cadena de carbono. El ácido eicosapentaenoico pertenece al primer grupo, en particular ácido eicosapentaenoico con dobles enlaces en la posición 5, 8, 11, 14 y 17 (EPA) y ácido docosahexaenoico, en particular ácido docosahexaenoico con dobles enlaces en la posición 4,7,10, 13,16, 19 (DHA), mientras, por ejemplo, ácido araquidónico (ARA) pertenece al último grupo.

Los PUFA son esenciales para los seres humanos, y se ha probado que tienen efectos muy beneficiosos en la salud humana, incluyendo un desarrollo apropiado del cerebro y funciones visuales y prevención de enfermedad, tales como enfermedad cardiovascular y cáncer.

El ácido araquidónico omega-6 PUFA juega un papel importante en la estructura y función de membranas biológicas, y es un precursor de las prostaglandinas y leucotrienos biológicamente activas. Ácido araquidónico es necesario para el desarrollo neurológico y neurofisiológico de tanto niños nacidos a término como prematuros, y muchas organizaciones de expertos, incluyendo la Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y Alimentación (FAO) y la Organización Mundial de la salud (WHO) recomiendan que la fórmula de niños debe estar suplementada con ácido araquidónico.

El omega-3 PUFA EPA y DHA, también, posee un número de funciones biológicas en seres humanos. Son parte del tejido humano, y en el segmento exterior del bastón en la retina, DHA representa más de 60% de los ácidos grasos totales. DHA se considera que es esencial para la función visual apropiada y el desarrollo neurológico de los niños. Los niños prematuros y jóvenes son incapaces de sintetizar cantidades suficientes de DHA y reciben el resto mediante la leche de pecho. DHA también reduce o elimina el factor de riesgo implicado en diversas enfermedades como enfermedades cardiovasculares y ejerce efectos positivos sobre la hipertensión, artritis, arteriosclerosis y trombosis.

Diversas, patentes solicitudes de patente se centran en la producción de PUFA a partir de sustratos de ácidos grasos. Recientemente, la ruta del ácido linoleico a ácido araquidónico se reconstituyó en S. cerevisiae (Domergue et al., 2003, Beaudoin et al., 2000) y la síntesis de ácidos grasos poliinsaturados se estableció suministrando el metabolito precursor, ácido linoleico, al medio.

Otros grupos han establecido partes de la ruta PUFA en los experimentos de reconstitución. Por ejemplo, el documento US 6.432.684 describe la secuencia de una delta-5 desaturasa de ser humano, que, cuando se expresa, produce ácido araquidónico, cuando se suministra ácido dihomo-gamma-linolénico.

El documento US 2002/0170090 describe una omega-3 desaturasa a partir de Caenorhabditis elegans y su expresión en diversos organismos incluyendo bacterias, cianobacterias, fitoplancton, algas, hongos, plantas y animales, y la producción de un lípido a partir de un organismo que expresa la omega-3 desaturasa. La enzima cataliza la conversión de ácidos grasos omega-6 con 18, 20 y 22 átomos de carbono a los ácidos grasos omega-3 correspondiente. Células de levadura, que expresan la omega-3 desaturasa de C. elegans, convertía el ácido linoleico suministrado de manera exógena y ácido omega-6 docosatetraenoico en ácido alfa-linolénico y ácido omega-3 docosapentaenoico, respectivamente.

El documento PCT/US98/07422 describe el aislamiento de una delta-5 desaturasa de Mortierella alpina y expresión de dicha enzima en células microbianas, en particular en Saccharomyces cerevisiae, y reseña la producción de ácido araquidónico cuando de suministra ácido dihomo-gamma-linolénico en el medio de crecimiento.

El documento WO 99/27111 describe una delta-6 desaturasa de C. elegans y su expresión en levadura, que conduce a la producción de ácido gamma-linolénico a partir de ácido oleico suministrado de manera exógena.

En el documento WO 99/33958, se describe la expresión de una delta-5 desaturasa (obtenida originalmente de C. elegans) en microorganismos, tales como algas, bacterias y hongos, y en particular, su expresión en levadura.

El documento WO 02/44320 describe un número de diferentes elongasas humanas, muchas de las cuales se han ensayado para funcionalidad en levadura usando un número de diferentes ácidos grasos como sustratos suministrados externamente.

Un procedimiento para la producción de ácido araquidónico en organismos

transgénicos (documento WO 03/012092) se ha aplicado. En el presente documento, los inventores describen la expresión de una delta-5 desaturasa, que conduce a la producción de ácido araquidónico en levadura; sin embargo, requiere ácido dihomo-gamma linolénico como sustrato externo.

Los inventores del documento PCT/US98/07421 ensayan la expresión de diversas desaturasas incluyendo delta-12 desaturasa, delta-6 desaturasa y delta-5 desaturasa y reconstituyen la función de estas enzimas mediante la adición de sustratos de ácido graso al medio de crecimiento y analizando su conversión.

En todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente anteriormente mencionadas, se han descrito procedimientos, cuando es necesario suministrar ácidos grasos como sustratos externos en el medio con el fin de producir los PUFA.

En lo siguiente se describen unas pocas publicaciones, que reseñan la producción de PUFA con hasta 3 dobles enlaces a partir de sustratos de ácido no graso.

En el documento US 6.355.861 se muestra que la expresión de delta-12 y delta-6 desaturasa de Cynecosystis en Cynecococcus conduce tanto a la producción de ácido linoleico como ácido gamma-linolénico, ácidos grasos con dos dobles enlaces y tres dobles enlaces, respectivamente. Además, se describe la expresión de una delta-6 desaturasa de prímula en una bacteria, hongo o célula vegetal, incluyendo la expresión de dicha delta-6 desaturasa en diversas plantas para la producción de ácido gamma-linolénico.

El documento US 6.136.574 describe la producción de ácido gamma-linoleico en levadura a partir de ácido oleico disponible de manera endógena.

El documento PCT/US98/07126 describe la expresión de una delta-6 desaturasa y una delta-12 desaturasa y reseña, por ejemplo esa expresión de estos genes en una célula huésped conduce a la producción de ácido gamma-linoleico.

Ninguna referencia de la técnica anterior describe la producción exitosa de PUFA heterólogo con cuatro o más dobles enlaces en microorganismos a partir de fuentes de carbono diferentes de los ácidos grasos, a pesar del hecho que un alto número de genes diferentes implicados en la biosíntesis de PUFA se han identificado. Esto demuestra claramente que es una tarea difícil producir los PUFA con cuatro o más dobles enlaces a titulaciones suficientes o detectables en microorganismos que usualmente no producen PUFA. Aunque los inventores del documento US 2003/0177508 describen secuencias de cuatro genes que están implicados en la elongación de PUFA y muestran la función de todos estos genes, los inventores pueden solamente especular en un ejemplo (ejemplo III) esa expresión de delta-12 desaturasa, delta-6 desaturasa, delta-5 desaturasa, y un ADNc de elongasa de Mortierella alpina en levadura podría dar como resultado la producción de ácido araquidónico

sin la necesidad de suministro exógeno de ácidos grasos.

Como un resumen intermedio de los anteriores párrafos, se puede concluir que, excepto para las especulaciones especificadas en el documento US 2003/0177508, no ha...

1. Un procedimiento para producir ácidos grasos poliinsaturados con cuatro o más dobles enlaces que comprende la expresión heteróloga de una ruta que requiere oxígeno en un Saccharomyces cerevisiae desarrollado sobre un sustrato de ácido no graso, en el que la expresión heteróloga comprende la combinación de la expresión heteróloga de secuencias de nucleótidos que codifican delta-12 desaturasa, delta-6 desaturasa, delta-6 elongasa, delta-5 desaturasa y delta-9 desaturasa.

2. Un procedimiento para producir ácidos grasos poliinsaturados con cuatro o más dobles enlaces que comprende la expresión heteróloga de una ruta que requiere oxígeno en un Saccharomyces cerevisiae desarrollado sobre un sustrato de ácido no graso, en el que la expresión heteróloga comprende la combinación de la expresión heteróloga de secuencias de nucleótidos que codifican delta-12 desaturasa, delta-9 elongasa, delta-8 desaturasa, delta-5 desaturasa y delta-9 desaturasa.

3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho sustrato de ácido no graso es la fuente de carbono exclusiva.

4. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la expresión heteróloga combinada además comprende la expresión heteróloga de una secuencia de nucleótidos que codifica delta-5 elongasa, omega-3 desaturasa, y / o delta-4 desaturasa.

5. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha expresión heteróloga combinada además comprende una sobreexpresión de al menos uno de los genes seleccionados entre el grupo que consta de ACC1, YBR159W, FAS1, y FAS2.

6. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha expresión heteróloga combinada además comprende una supresión de POX1.

7. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha expresión heteróloga combinada además comprende una expresión heteróloga de las secuencias de nucleótidos que codifican ATP:citrato liasa.

8. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha expresión heteróloga combinada además comprende una supresión del gen GDH1 y opcionalmente una sobreexpresión de al menos uno de los genes seleccionados entre el grupo que consta de GDH2, GLN1 y GLT1.

9. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que

dicha expresión heteróloga combinada además comprende una sobreexpresión de al menos uno de los genes seleccionados entre el grupo que consta de TSC13, GAT1, SLC1 y YDR531W.

10. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dichas secuencias de nucleótidos heterólogas son de codón optimizado para la expresión en Saccharomyces cerevisiae.

11. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho Saccharomyces cerevisiae está cultivado en un medio deficiente en mioinositol.

12. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el ácido graso poliinsaturado está seleccionado entre el grupo que consta de ácido araquidónico, ácido eicosapentaenoico y ácido docosahexaenoico.

13. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha expresión heteróloga incrementa el contenido de ácido araquidónico, ácido eicosapentaenoico y / o ácido docosahexaenoico hasta más de 2 % del contenido de ácido graso total en dicho Saccharomyces cerevisiae

14. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica delta-12 desaturasa está seleccionada entre el grupo que consta de a) las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID Números 5 -10, 93, 95, y 113; y b) secuencias de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID Números 5 -10, 93, 95, y 113.

15. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica delta-9 desaturasa está seleccionada entre el grupo que consta de a) las secuencias de nucleótidos definidas en SEQ ID NO: 1-4; y b) secuencias de nucleótidos que tienen al menos 75% de identidad con las secuencias de nucleótidos definidas en SEQ ID NO: 1 -4.

16. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica delta-5 desaturasa está seleccionada entre el grupo que consta de a) las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 22 -27, 99, 105 y 107; y b) secuencias de nucleótidos que tienen al menos 75% de identidad con las secuencias de nucleótidos definidas en SEQ ID NO: 22 -27, 99, 105 y 107.

17. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 -16, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica delta-9 elongasa es una secuencia de nucleótidos que

comprende o que tiene al menos 75% de identidad con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 37.

18. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 -16, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica delta-8 desaturasa es una secuencia de nucleótidos que comprende o que tiene al menos 75% de identidad con la secuencia de nucleótidos of SEQ ID NO: 38.

19. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 y / o 3 -16, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica delta-6 desaturasa está seleccionada entre el grupo que consta de a) las secuencias de nucleótidos definidas en SEQ ID. NO: 11 -15, 97, y 99; y b) secuencias de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con las secuencias de nucleótidos definidas en SEQ ID NO: 11-15, 97, y 99.

20. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 y / o 3-16, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica delta-6 elongasa eatá seleccionada entre el grupo que consta de a) las secuencias de nucleótidos definidas en SEQ ID NO: 16-21, 101 and 103; and b) secuencias de nucleótidos que tiene al menos 75% de identidad con las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 16-21, 101 y 103.

21. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 -16, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica delta-5 elongasa eatá seleccionada entre el grupo que consta de a) las secuencias de nucleótidos definidas en SEQ ID NO: 19, 28, 29 y 101; b) secuencias de nucleótidos que tienen al menos 75% de identidad con las secuencias de nucleótidos establecidas en SEQ ID NO: 19, 28, 29 y 101; y c) secuencias de nucleótidos que codifican secuencias de aminoácidos que tienen al menos 75% identidad con SEQ ID NO 68.

22. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 -16, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica delta-4 desaturasa está seleccionada entre el grupo que consta de a) las secuencias de nucleótidos definidas en SEQ ID NO: 35 -36 y 109; b) secuencias de nucleótidos que tienen al menos 75% de identidad con las secuencias de nucleótidos definidas en SEQ ID NO: 35 -36 y 109; y c) secuencias de nucleótidos que codifican secuencias de aminoácidos que tienen al menos 75% identidad con SEQ ID Números 76 -77.

23. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4-16, en el que la

secuencia de nucleótidos que codifica omega-3 desaturasa está seleccionada entre el grupo que consta de a) las secuencias de nucleótidos definidas en SEQ ID NO: 30 -34, 87, 89 y 111; y b) secuencias de nucleótidos que tienen al menos 75% de identidad con las secuencias de

5 nucleótidos definidas en SEQ ID NO: 30 -34, 87, 89 y 111.

24. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende la etapa de recuperación de dicho ácido graso poliinsaturado.

25. Un Saccharomyces cerevisiae modificado genéticamente capaz de producir ácidos grasos poliinsaturados con cuatro o más dobles enlaces cuando se desarrolla sobre un sustrato de

10 ácido no graso, en el que dicho Saccharomyces cerevisiae comprende la expresión heteróloga de secuencias de nucleótidos que codifican delta-12 desaturasa, delta-6 desaturasa, delta-6 elongasa, delta-5 desaturasa y delta-9 desaturasa.

26. Un Saccharomyces cerevisiae modificado genéticamente capaz de producir ácidos grasos poliinsaturados con cuatro o más dobles enlaces cuando se desarrolla sobre un sustrato de

15 ácido no graso, en el que dicho Saccharomyces cerevisiae comprende la expresión heteróloga de secuencias de nucleótidos que codifican delta-12 desaturasa, delta-9 elongasa, delta-8 desaturasa, delta-5 desaturasa y delta-9 desaturasa.