CÉLULAS MADRE OBTENIDAS DE PULPA DE DIENTES TEMPORALES O PERMANENTES Y DE GERMEN DENTAL, QUE PUEDEN PRODUCIR TEJIDO ÓSEO HUMANO.
Una población de células madre de origen mesenquimatoso y no hemático,
que se puede obtener a partir de pulpa de dientes temporales humanos, o de pulpa de dientes permanentes humanos o de gérmenes dentales y caracterizada por: i) expresión de marcadores c-Kit, STRO-1 y CD34; ii) diferenciación en progenitores osteogénicos que expresan RUNX2, a partir de los que se derivan osteoblastos que expresan HLA1, CD44, RUNX2, CD54 y osteocalcina; iii) capacidad para producir una matriz ósea fibrosa in vitro e in vivo;
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2005/008136.
Solicitante: TESLAB S.R.L.
Nacionalidad solicitante: Italia.
Dirección: Via G. Porzio, 4 Is A7 80143 Napoli ITALIA.
Inventor/es: DE ROSA, ALFREDO, CARINCI,FRANCESCO, D\'Aquino,Riccardo, Graziano,Antonio, Laino,Gregorio, Papaccio,Gianpaolo.
Fecha de Publicación: .
Fecha Solicitud PCT: 27 de Julio de 2005.
Clasificación Internacional de Patentes:
- A61L27/38 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE. › A61L PROCEDIMIENTOS O APARATOS PARA ESTERILIZAR MATERIALES U OBJECTOS EN GENERAL; DESINFECCION, ESTERILIZACION O DESODORIZACION DEL AIRE; ASPECTOS QUIMICOS DE VENDAS, APOSITOS, COMPRESAS ABSORBENTES O ARTICULOS QUIRURGICOS; MATERIALES PARA VENDAS, APOSITOS, COMPRESAS ABSORBENTES O ARTICULOS QUIRURGICOS (conservación de cuerpos o desinfección caracterizada por los agentes empleados A01N; conservación, p. ej. esterilización de alimentos o productos alimenticios A23; preparaciones de uso medico, dental o para el aseo A61K). › A61L 27/00 Materiales para prótesis o para revestimiento de prótesis (prótesis dentales A61C 13/00; forma o estructura de las prótesis A61F 2/00; empleo de preparaciones para la fabricación de dientes artificiales A61K 6/80; riñones artificiales A61M 1/14). › Células animales (para utilizar en piel artificial A61L 27/60).
- A61L27/38B8
- C12N5/06B18P
Clasificación PCT:
- C12N5/077 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 5/00 Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00). › Células mesenquimales, p. ej. Células óseas, células cartilaginosas, Células del estroma de la médula ósea, células adiposas o células musculares.
Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia.
PDF original: ES-2361527_T3.pdf
Fragmento de la descripción:
Antecedentes de la invención
La rehabilitación estética, morfológica y funcional del área oromaxilofacial ha alcanzado un alto nivel en las últimas décadas, debido al progreso de todas las disciplinas relacionadas con la odontología, tales como la anestesiología, la microcirugía y la farmacología.
Sin embargo, la pérdida ósea todavía es la etapa limitante para alcanzar una buena rehabilitación. La pérdida ósea se puede clasificar con respecto al sitio (es decir, relacionada con el área periodontal, mandibular, craneomaxilofacial, etc.), la calidad, el origen embrionario, las propiedades óseas mecánicas (relacionadas con la fuerza del hueso esponjoso; Trisi P. y Rao W. Bone classification: clinical-histomorphometric comparison. Clin. Oral Implants Res. 1999, 10:1-7) y la cantidad (que se puede definir como el volumen total de hueso perdido).
El hueso perdido puede implicar el área periodontal, las mandíbulas, el esqueleto craneofacial y sitios de diferentes partes del cuerpo. Son varias las causas implicadas:
1 -Déficit de estructuras anatómicas que fijan los dientes a las mandíbulas. Los dientes se fijan en el hueso alveolar por medio del periodonto, compuesto de encía, cemento, ligamento periodontal y hueso alveolar. Son muchas las enfermedades periodontales debidas a factores genéticos y ambientales. El signo clínico es una resorción ósea alveolar y una pérdida de la unión a los dientes. El grado de enfermedad se puntúa como la pérdida ósea vertical y el número de paredes alveolares implicadas. Como la longitud máxima de raíz dental es alrededor de 20 mm, la pérdida ósea vertical máxima con los dientes todavía en su sitio no puede ser mayor (Lindhe J., Parodontologia, Edi-Ermes, Milán, 1991). Las enfermedades periodontales son epidémicas. En algunas áreas geográficas, más del 10% de la población tiene bolsas periodontales que se pueden examinar a más de 5 mm (Orozco A.H. y col., Periodontal treatment needs in a native island community in Columbia. Int. Dent. J. 2004, 54: 73-76). Todos estos pacientes necesitan una terapia específica para restaurar el hueso alveolar perdido.
2 -Déficit de hueso en las mandíbulas. Estos déficits tienen varias causas, tales como edentulismo parcial o total (que provoca la resorción ósea alveolar), traumatismo y tumores. Entre los tumores, el carcinoma de células escamosas oral es la enfermedad maligna más frecuente de la boca con aproximadamente 30.000 nuevos casos y
8.000 pacientes muertos por año en los EE.UU. (Greenlee R., y col. Cancer statistic. Cancer J. Clin. 2001, 51: 15-36). Con respecto a los traumatismos faciales, no está disponible aún ningún informe nacional, pero el número de pacientes tratados es muy alto si se considera que un único centro puede operar a más de 1.000 pacientes por año (Gassner R. y col. Cranio-maxillo-facial trauma: a 10 year review of 9,543 cases with 21,067 injures. J Craniomaxillofacial Surg. 2003, 31: 51-61).
3 -Déficit de hueso en el área craneofacial.
Existen varias causas que determinan la pérdida ósea. Entre ellas están las secuelas postraumáticas, la resección craneofacial para la eliminación de tumor y las malformaciones. Ejemplos de malformaciones congénitas que requieren injertos óseos autólogos son el labio leporino y la fisura palatina (en este caso el injerto óseo autólogo se inserta en la hendidura del borde alveolar) y el síndrome de Treacher-Collins (en este caso se usa una costilla para restaurar la mandíbula).
4 -Déficit de tejido óseo fuera de la región craneal.
Existen varias causas que determinan la pérdida ósea. Entre ellas están las secuelas postraumáticas, la resección ósea para la eliminación de tumor y las malformaciones. En todos estos casos, la disponibilidad del hueso autólogo para restaurar el déficit es la etapa limitante que tiene que superar la cirugía ortopédica en la práctica diaria.
Como se indica anteriormente, el déficit óseo se puede clasificar como secundario (como en la enfermedad periodontal) si el defecto de volumen óseo es de aproximadamente unos pocos milímetros por lado y principal si la pérdida ósea es más grande.
Actualmente para corregir defectos óseos existen varios biomateriales y diferentes técnicas quirúrgicas. Todas ellas tienen ventajas y desventajas.
En defectos óseos secundarios, existen varios procedimientos médicos y quirúrgicos para evitar y restablecer la enfermedad periodontal. Sin embargo, cuando las enfermedades periodontales son graves, se necesita restaurar el déficit óseo. Esto se puede lograr usando material aloplástico o heterólogo/xenoinjerto. Ambos pueden producir osteoinducción y/o osteoconducción. En los mismos casos, el odontólogo puede usar membranas que determinan una separación física entre el epitelio y el hueso subyacente.
En los defectos óseos principales existen tres posibilidades terapéuticas: 1) uso de material aloplástico (tal como malla para reconstruir la mandíbula o prótesis de cadera), 2) uso de injerto óseo autólogo (tal como injerto de cresta ilíaca para reconstruir el arco mandibular o colgajos libres recogidos de fíbula, antebrazo, cresta ilíaca, etc.), 3) osteogénesis por distracción.
En cualquier caso, el estándar establecido es el uso de hueso autólogo. El uso de hueso heterólogo o de xenoinjerto puede conducir a que no se produzca autorreacción y también a una transmisión de enfermedades desconocidas, mientras que el uso de materiales no aloplásticos no restaura el déficit y además tiende a inducir infecciones y reacciones a cuerpos extraños. Actualmente existen varios límites a un uso extensivo de injertos óseos autólogos: 1) la morbilidad en el sitio donante (es decir, fíbula, antebrazo, cresta ilíaca, etc.) no siempre es aceptable en su conjunto si se considera que algunas veces el injerto falla; 2) la estrategia quirúrgica tiene costes relevantes con respecto a los instrumentos y al equipo de entrenamiento; 3) la recogida del injerto del sitio donante aumenta el tiempo de operación; 4) no es posible recoger una gran cantidad de hueso del sitio donante puesto que puede provocar secuelas en él.
Teniendo en cuenta lo que se indica anteriormente, se puede concluir que: 1) el déficit óseo es la etapa limitante en la reconstrucción odontológica, maxilofacial y ortopédica; 2) el hueso autólogo es el estándar establecido; 3) recoger hueso autólogo de un sitio diferente del mismo paciente conduce a riesgos adicionales para el paciente en sí, requiriendo un entrenamiento de equipo específico y tiene costes biológicos y económicos.
Una posible solución a estos factores adversos es el uso de un hueso autólogo producido in vitro usando citotipos específicos. Desde este punto de vista, el uso de células madre (que se pueden diferenciar en osteoblastos que producen hueso in vitro) puede ser una buena estrategia.
Las células madre son células caracterizadas por: 1) autorenovación (es decir, no hay límite con respecto al posible número de división celular); 2) compromiso y diferenciación en diferentes líneas celulares. En la bibliografía, se ha indicado la identificación de células madre derivadas de la médula ósea que se puede diferenciar en osteoblastos (Kuznetsov S.A., y col. Single-colony derived strains of human marrow fibroblasts from bone after transplantation in vivo. J. Bone Min. Res. 1997; 12, 1335-47; Pittenger M.F., y col. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 1999, 284, 143-147), pero no se describe la capacidad de estas células (denominadas células madre estromales de la médula ósea (BMSSC)) para producir hueso en una estructura tridimensional in vitro. Más recientemente, se ha descrito el aislamiento y la caracterización de células madre, derivadas de pulpa dental humana. (Gronthos S. y col., PNAS 2000, 97, 13625-13630; Gronthos S. y col., JDR 2002, 81, 531-535; Batouli S. y col., JDR 2003, 82, 976-981; patente de los EE.UU. n.º 20040058442 de Shi y col. Shi S y col., J. Bone Min, Res., 2003, 18, 696-703). Específicamente, la línea de células madre de pulpa dental (DPSC) es un precursor de osteoblastos y se caracteriza por: 1) la presencia de sialoproteína de la dentina específica; 2) la ausencia de producción ósea in vitro; 3) la producción de estructuras similares a la dentina in vivo, cuando las células se trasplantaron en ratones inmunodeficientes.
Miura M y col. (PNAS 2003; 100, 5807-5812) describen una clase adicional de células madre obtenidas a partir... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Una población de células madre de origen mesenquimatoso y no hemático, que se puede obtener a partir de pulpa de dientes temporales humanos, o de pulpa de dientes permanentes humanos o de gérmenes dentales y
caracterizada por:
i) expresión de marcadores c-Kit, STRO-1 y CD34;
ii) diferenciación en progenitores osteogénicos que expresan RUNX2, a partir de los que se derivan osteoblastos que expresan HLA1, CD44, RUNX2, CD54 y osteocalcina; iii) capacidad para producir una matriz ósea fibrosa in vitro e in vivo;
2. Un procedimiento para aislar la población de células madre de la reivindicación 1, que comprende las etapas de:
- digestión enzimática de pulpa dental;
- recuperación de la fracción celular mediante centrifugación y/o filtración; -obtención de cultivo primario y expansión del mismo;
- selección de clasificación FAC usando marcadores CD34, STRO-1 y c-Kit y expansión en medio de cultivo.
3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la digestión enzimática de la pulpa se lleva a cabo usando 3 mg/ml de colagenasa de tipo I, 4 mg/ml de dispasa, 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina, 500 µg/ml de claritromicina en PBS, durante 1 hora a 37ºC, bajo agitación.
4. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la expansión celular se obtiene usando medio de cultivo específico para la proliferación de células madre.
5. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el medio de cultivo para la expansión celular se prepara de: medio de cultivo ºMEM, añadido de suero fetal bovino al 20%, ácido ascórbico 2P 100 µM, L-glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina y la incubación se realiza en matraces de 25 cm2 a 37ºC y con CO2 al 5%, realizando cambios del medio dos veces por semana.
6. Procedimiento para la producción de una matriz ósea tejida, que comprende inducir la proliferación de la población de células madre de la reivindicación 1 durante 5-10 días, hasta que las células sean confluentes, en matraces que contienen los siguientes medios de cultivo:medio de cultivo ºMEM añadido de suero fetal bovino al 20%, ácido ascórbico 2P 100 µM, L-glutamina 2mM, 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina,
de modo que la población de células madre de la reivindicación 1 se diferencia en una línea celular osteoblástica.
7. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicha matriz ósea fibrosa contiene osteoblastos vivos.
8. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la matriz ósea tejida consiste en fragmentos con un espesor mayor de 1 cm y un volumen mayor de 1 cm3, para usarse para implante quirúrgico.
9. Un procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 6-8, en el que el material biológico se almacena a 44ºC o a una temperatura inferior a 0ºC.
10. El uso de una población de células madre de acuerdo con la reivindicación 1, para la preparación de biomateriales autólogos, para el tratamiento de defectos óseos relacionado con problemas odontológicos, maxilofaciales y ortopédicos.
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