Un conjunto de cebadores para la amplificación de ácidos nucleicos para detectar citoqueratina 19 humana por el método LAMP que comprende al menos cuatro tipos de cebadores,

en el que dicho conjunto de cebadores comprende un oligonucleótido de acuerdo con la SEC ID Nº: 419, o una cadena complementaria de la SEC ID Nº: 419; o un cebador capaz de hibridar con el cebador de acuerdo con la SEC ID Nº: 419 o el complemento del mismo en condiciones rigurosas.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un conjunto de cebadores de amplificación de ácidos nucleicos para la detección de la citoqueratina 19 humana por el método LAMP.

Técnica antecedente

Las citoqueratinas (denominadas en lo sucesivo “CK”) son proteínas que forman el esqueleto fibroso de una célula y forman una familia de al menos 20 genes. Como dichas citoqueratinas se conocen la CK18 humana, CK19 humana, CK20 humana y similares. Las CK se expresan en células epiteliales.

Por ejemplo, ciertos informes previos describieron que la CK18 humana se expresa no solo en tejidos normales tales como glándula mamaria, pulmón, intestino delgado y estómago, sino también en tejidos cancerosos, mientras que la CK18 humana no se expresa en ganglios linfáticos que no son tejidos epiteliales. En cuanto a la CK19 humana, ciertos informes previos describieron que se expresa en cáncer de pulmón, cáncer de estómago, cáncer de mama, cáncer pancreático, cáncer de próstata y similares, y se observó una diferencia en el nivel de expresión de la CK19 humana entre tejidos normales y tejidos cancerosos. En cuanto a la CK20 humana, diversos informes describieron que se expresa en cáncer de colon, cáncer de estómago, cáncer de células Merkel, cáncer mucoso ginecológico, cáncer de células de transición, cáncer pancreático y cáncer de conductos biliares, y también en este caso se observa una diferencia en el nivel de expresión de CK20 humana entre tejidos normales y tejidos cancerosos.

En relación con los hechos anteriores, es posible conocer la presencia/ausencia de metástasis de cáncer mediante el examen de la presencia/ausencia de expresión de CK18 humana, CK19 humana y/o CK20 humana en tejidos tales como ganglios linfáticos. También es posible conocer la presencia/ausencia de metástasis de cáncer buscando los que presentan diferencias en el nivel de expresión entre tejidos normales y tejidos cancerosos.

Una célula cancerosa que deja el sitio primario de la lesión mestastizará en el cuerpo a través del torrente sanguíneo y el sistema linfático. En una operación quirúrgica de cáncer, se necesita una detección precisa de la metástasis y un tratamiento apropiado basado en el grado de metástasis para eliminar las lesiones de una forma tan fiable como sea posible. Por esta razón, tiene una gran importancia el diagnóstico intraoperatorio de metástasis de cáncer en ganglios linfáticos. Por ejemplo, en el caso del cáncer de mama, la zona a eliminar se está volviendo más pequeña para mejorar la CDV, y el diagnóstico de metástasis en ganglios linfáticos durante la cirugía puede ser una pauta importante para determinar el mínimo de disección de ganglios linfáticos. En caso de cáncer esofágico, la detección de un sitio en el que se produce metástasis de ganglios linfáticos puede proporcionar directrices para la selección y determinación de procedimientos operatorios incluyendo ventrotomía, toracotomía e incisión en collar. En caso de cáncer de próstata, la presencia de metástasis en ganglios linfáticos proporcionará directrices para decidir aplicar una terapia hormonal mientras se detiene la prostatectomía. También en caso de cáncer de estómago, dará directrices para seleccionar un procedimiento operatorio y una estrategia terapéutica después de la cirugía. Teniendo en cuenta la carga sobre el paciente, debe realizarse rápidamente el diagnóstico intraoperatorio de metástasis de cáncer.

Un procedimiento para diagnosticar metástasis de cáncer en ganglios linfáticos es detectar proteínas CK que son marcadores tumorales. Por ejemplo, esto se consigue congelando un ganglio linfático reseccionado y tiñendo una sección del tejido congelado. Sin embargo, este procedimiento va acompañado del riesgo de que se pasen por alto micrometástasis porque solo se basa en la información sobre la sección.

Un desarrollo reciente en técnicas de análisis de genes ha permitido diagnósticos eficaces de cáncer mediante la detección de la expresión de genes de marcadores tumorales. Por ejemplo, la técnica PCR permite amplificar un fragmento de ADN diana varios cientos de veces por repetición de la disociación de cadenas de ADN en un ADN monocatenario, unión de cebadores que intercalan una región específica en la cadena de ADN y síntesis de ADN por la ADN polimerasa (véase el documento JP-A 61-274697), y puede usarse como técnica de análisis muy sensible para ácidos nucleicos en diversos tipos de muestras. Por ejemplo, como la técnica PCR puede analizar ácidos nucleicos en muestras obtenidas a partir de fluidos o tejidos del cuerpo de un animal, es útil para el diagnóstico de enfermedades infecciosas, enfermedades genéticas, cánceres y similares.

Para la detección del ARN, puede usarse la técnica RT-PCR. La técnica RT-PCR implica extraer ARN, por ejemplo, a partir de tejidos tumorales; sintetizar ADNc con la ayuda de la transcriptasa inversa (RT) usando oligo (dT) o un hexámero aleatorio como cebador; y amplificar el ADNc usando la técnica PCR para la detección. Se ha notificado el caso ejemplar del diagnóstico de tumor de fibroblastos usando la técnica RT-PCR (Hokkaido Igaku Zasshi p.135141, Vol.66 (2), (1991)). La RT-PCR hace posible detectar la expresión de ARNm de CK a partir de tejidos extirpados, de forma que puede evitarse el problema, en alguna medida, de que se pasen por alto metástasis de cáncer. En el campo de diagnóstico de tumores o cánceres, se han puesto en uso práctico dichos métodos de amplificación de ácidos nucleicos ("Kanai's manual of clinical laboratory medicine", 31ª ed., págs. 1314, KANEHARA&Co., LTD., publicado el 20 de septiembre de 1998).

Sin embargo, la técnica PCR necesita una operación para desnaturalizar un ADN molde a partir de un ADN bicatenario en una sola cadena, y además requiere reacciones de amplificación repetitivas en varias condiciones de temperatura. Además, en general, se tardan aproximadamente dos horas en obtener un producto amplificado detectable, de forma que no era deseable como ensayo intraoperatorio que requiere rapidez.

Como método de amplificación de ADN distinto de la técnica PCR, se ha presentado el método LAMP (véase la Publicación Internacional WO 00/28082). El método LAMP es un método de amplificación génica que usa una pluralidad de cebadores incluyendo un cebador que forma una estructura de horquilla en un extremo del producto amplificado según avanza la reacción de desplazamiento de cadena. En una reacción inicial, usando dos tipos de cebadores internos (FIP, RIP) y dos tipos de cebadores externos (cebador F3, cebador R3) y una ADN polimerasa de desplazamiento de cadena, se sintetiza una estructura de tipo pesa que tiene un bucle monocatenario en cada extremo a partir de un ADN molde. Partiendo de esta estructura, se realiza el ciclo de amplificación de forma que la extensión y síntesis del ADN continúan en el propio ADN como molde, desde el extremo 3' de esta estructura. El producto amplificado comprende una estructura repetida de múltiples unidades, y cada unidad comprende un conjunto de regiones complementarias en la misma cadena que forman una región a amplificar intercalada entre los cebadores donde dos ácidos nucleicos tienen secuencias de bases invertidas. El método LAMP no requiere la operación de desnaturalización de un ADN molde desde una doble cadena a una sola cadena por calentamiento, y se caracteriza por un proceso de amplificación continuo a una temperatura constante (véase Bio Venture, Vol. 1, p. 109-115 (2001) y BIO INDUSTRY, Vol.18, No.2, p.15-29 (2001)). Cuando el molde es ARN, es posible sintetizar la estructura de partida de una manera similar añadiendo una transcriptasa inversa a la composición de la mezcla de reacción, con lo que puede realizarse la amplificación (método RT-LAMP). De acuerdo con el método LAMP, puede obtenerse una cantidad suficiente de producto amplificado para la detección en aproximadamente 30 minutos. Por lo tanto, el tiempo necesario para la detección se reduce, de manera que puede aplicarse para el diagnóstico de metástasis de cáncer en ganglios linfáticos con el objetivo, por ejemplo, de una determinación rápida de la estrategia terapéutica. Además, como puede conseguirse un resultado rápidamente, también es de esperar la aplicación al diagnóstico intraoperatorio.

El concepto básico de cebadores aplicados al método LAMP puede encontrarse en la Publicación Internacional nº WO 00/28082 y en la Publicación Internacional nº WO 02/24902.

Ya se han presentado cebadores y sondas a usar en... [Seguir leyendo]

1. Un conjunto de cebadores para la amplificación de ácidos nucleicos para detectar citoqueratina 19 humana por el método LAMP que comprende al menos cuatro tipos de cebadores, en el que dicho conjunto de cebadores

5 comprende un oligonucleótido de acuerdo con la SEC ID Nº: 419, o una cadena complementaria de la SEC ID Nº: 419; o un cebador capaz de hibridar con el cebador de acuerdo con la SEC ID Nº: 419 o el complemento del mismo en condiciones rigurosas.

2. Un método para detectar citoqueratina 19 humana por el método LAMP usando el conjunto de cebadores de 10 acuerdo con la reivindicación 1.

3. Uso del conjunto de cebadores de acuerdo con la reivindicación 1 para la detección de un ácido nucleico de citoqueratina 19 en una muestra usando el método LAMP.