BIOSÍNTESIS DE ASTAXANTINA EN EUCARIOTAS.
Un vector que comprende (a) una secuencia de ADN, que codifica la proteína fitoeno desaturasa,
la cual posee en una posición una sustitución de aminoácidos que confiere una resistencia frente a herbicidas, y (b) un sitio de clonación múltiple (MCS), en el que se puede introducir por clonación una secuencia arbitraria de ADN, realizándose que la secuencia de ADN que codifica la proteína fitoeno desaturasa, tomando en cuenta la degeneración del código genético, codifica una proteína de acuerdo con la SEQ ID NO:2, teniendo la proteína de acuerdo con la SEQ ID NO:2 un intercambio de aminoácidos de leucina por arginina en la posición 504
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2006/009881.
Solicitante: PETER UND TRAUDL ENGELHORN-STIFTUNG ZUR FÖRDERUNG DER BIOTECHNOLOGIE UND GENTECHNIK.
Nacionalidad solicitante: Alemania.
Dirección: ALEMANIA.
Inventor/es: STEINBRENNER,JENS.
Fecha de Publicación: .
Fecha Solicitud PCT: 12 de Octubre de 2006.
Fecha Concesión Europea: 18 de Agosto de 2010.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12N9/02 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › Oxidorreductasas (1.), p. ej. luciferasa.
Clasificación PCT:
- A01H5/00 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A01 AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA. › A01H NOVEDADES VEGETALES O PROCEDIMIENTOS PARA SU OBTENCION; REPRODUCCION DE PLANTAS POR TECNICAS DE CULTIVO DE TEJIDOS. › Angiospermas,es decir, plantas con flores, caracterizadas por sus partes vegetales; Angiospermas caracterizadas de forma distinta que por su taxonomía botánica.
- C12N15/53 C12N […] › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Oxidorreductasas (1).
- C12N15/82 C12N 15/00 […] › para células vegetales.
Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia.
Fragmento de la descripción:
Biosíntesis de astaxantina en eucariotas.
El invento se refiere a un vector de ADN, que posee (a) una secuencia de ADN, que codifica la proteína fitoeno desaturasa, que está modificada en una posición por medio de un intercambio de aminoácidos que confiere una resistencia, y (b) un sitio de clonación múltiple (en inglés "multiple cloning site"), en el que se puede introducir por clonación una secuencia arbitraria de ADN, a su utilización para la transformación de células de eucariotas y a procedimientos para la transformación y a unas células de plantas transgénicas producidas de esta manera.
Antecedentes del invento
Los carotenoides son unos pigmentos que se presentan en todos los organismos fotosintéticos. Ellos desempeñan un cometido importante como componentes del centro de reacción fotosintética y en el caso de la protección contra daños causados por fotooxidación.
La ruta de biosíntesis de los carotenoides transcurre desde el geranil-geranil difosfato (GGDP) hasta la astaxantina. Mediante la condensación de dos moléculas de pirofosfato de geranil-geranilo, la fitoeno sintasa (PSY) forma el cuerpo de C40 fitoeno. Partiendo del fitoeno, la fitoeno desaturasa (PDS), mediante una separación de protones y la introducción de dos enlaces dobles, sintetiza el ξ-caroteno. El producto intermedio de esta etapa de síntesis es el fitoflueno. El ξ-caroteno es luego transformado químicamente de nuevo en licopina en una reacción de desaturación de dos etapas pasando por el producto intermedio neurosporina. La enzima responsable de esto es la ξ-caroteno desaturasa (ZDS). La licopina es transformada, pasando por una licopina ciclasa (LCYB), en el β-caroteno. Partiendo del β-caroteno, en la formación de astaxantina participan otras dos enzimas adicionales. Por una parte, la β-caroteno cetolasa (BKT) adosa junto a las posiciones 4 y 4' en cada caso un grupo ceto. Por otra parte, por medio de la carotenoide hidroxilasa (CHY) se engancha al anillo de iones del compuesto precursor de la astaxantina en cada caso un grupo hidroxilo junto a las posiciones 3 y 3'.
Mediante la sobreexpresión de una fitoeno sintasa bacteriana procedente de Eriwinia uredovora se pudo influir sobre, o estimular, la biosíntesis de los carotenoides en plantas transgénicas de tomate, y aumentar por consiguiente la cantidad sintetizada de carotenoides en el factor de 2-4 veces (Fraser, Romer y colaboradores 2002).
La posición clave primordial en la ruta de biosíntesis de los carotenoides es ocupada, no obstante, por la enzima fitoeno desaturasa (Fig. 1). Los genes pds, que codifican la fitoeno desaturasa, fueron clonados a partir de cianobacterias (Chamovitz y colaboradores, 1991; Martínez-Férez y Vioque, 1992; Martínez-Férez y colaboradores, 1994) y a partir de plantas superiores (Bartley y colaboradores, 1991; Pecker y colaboradores, 1992) y se sobreexpresaron con éxito en el seno de E. coli. El herbicida blanqueador norflurazona es conocido como un inhibidor reversible, no competitivo, de la fitoeno desaturasa. Para la cianobacteria Synechococcus se han descrito unas formas mutadas de la fitoeno desaturasa, que confieren a la bacteria una resistencia frente a norflurazona. Las mutaciones que confieren una resistencia, se basan en este contexto en cada caso en un único intercambio de aminoácidos. Dentro del marco de los estudios acerca de mutaciones, que se llevaron a cabo en Synechococcus, se encontraron unas resistencias para los siguientes intercambios de aminoácidos: Arg195Pro; Leu320Pro; Val403Gly; Leu437Arg (Linden y colaboradores 1990; Chamovitz y colaboradores, 1993). A pesar de que la norflurazona y otros herbicidas blanqueadores de este tipo son utilizados desde hace mucho tiempo para la represión de malezas, hasta ahora no se ha podido aislar ninguna planta resistente que esté presente en la naturaleza.
El documento de solicitud de patente internacional WO2004/007691 divulga unos vectores, que comprenden una secuencia de ADN que codifica en cada caso una fitoeno desaturasa, que en una posición tiene una sustitución de aminoácidos, que confiere una resistencia. Las secuencias que se divulgan de acuerdo con el documento WO2004/007691, proceden de las plantas multicelulares del género Hydrill y de soja, maíz y arroz.
Entre los compuestos intermedios y productos de la ruta de biosíntesis de los carotenoides, el cetocarotenoide astaxantina presenta en particular una importancia comercial. La astaxantina posee una actividad antioxidante más alta que la de otros productos intermedios de la ruta de biosíntesis de los carotenoides. La astaxantina actúa como un agente extintor (en inglés quencher) contra radicales libres y especies activas con oxígeno (Kobayashi y Sakamoto, 1999), como un agente reforzador de respuestas inmunitarias (Jyonouchi y colaboradores, 1995) y como un agente contra el cáncer (Tanaka y colaboradores, 1994, 1995). Debido a su efecto natural como un potente agente antioxidante, la astaxantina se emplea también como un agente de complemento nutritivo. Como aditivo para piensos con efecto de colorante, ella se utiliza también en la piscicultura.
Algunas especies de algas verdes tales como p. ej. Dunaliella bardawil y Haematococcus pluvialis poseen la capacidad singular de acumular carotenoides en condiciones de estrés. En este contexto, en particular la H. pluvialis se adecua para la producción natural de astaxantina. La H. pluvialis puede acumular astaxantina hasta llegar a un 4% de su peso en seco. En la producción comercial de astaxantina, la H. pluvialis desempeña un cometido primordial, en particular por el hecho de que la ruta de síntesis química para la producción de astaxantina se cuenta entre las más costosas, que se emplean comercialmente para la producción de una sustancia activa.
La transformación genética de algas verdes se describió múltiples veces para Chlamydomonas reinhardtii y para algunas especies de Chlorella (Kindle 1990; Lumbreras y colaboradores 1998; Hawkins y Nakamura, 1999; Kim y colaboradores 2002). Las dos especies de algas son consideradas como poco interesantes para la producción a gran escala de carotenoides debido a su metabolismo.
La transformación genética de H. pluvialis fue descrita por Teng y colaboradores (2003). Por medio de un bombardeo con micropartículas, el gen reportero de la β-galactosidasa lacZ fue integrado bajo el control del promotor de SV40 en el genoma de algas. Las células de algas transformadas con éxito tienen que ser detectadas y seleccionadas individualmente mediando toma de ayuda de medios ópticos.
Las células de algas transformadas con el gen lacZ no poseen ninguna resistencia frente a agentes de selección que actúan de manera tóxica o respectivamente dominante.
A pesar de que la biosíntesis de astaxantina se investigó detalladamente durante los últimos 10 años (Lu y colaboradores, 1995; Fraser y colaboradores, 1998), la producción de astaxantina por medio de H. pluvialis a gran escala biotecnológica sigue siendo todavía problemática, puesto que, entre otras cosas, la división celular es inhibida durante la biosíntesis de astaxantina (Boussiba y von Vonshak, 1991).
Es una misión de este invento poner a disposición un vector de ADN, que se pueda utilizar para modificar genéticamente de un modo adecuado, al genoma de células de eucariotas, en particular de algas tales como H. pluvialis, con el fin de poder influir de esta manera sobre, o respectivamente aumentar, la síntesis in vivo de carotenoides e isoprenoides naturales, y en particular la biosíntesis de astaxantina. Constituye una misión adicional del invento el poner a disposición un vector, que se pueda emplear como marcador selectivo dominante para la transformación en células de eucariotas, en particular de algas tales como H. pluvialis, y que haga posible seleccionar de un modo sencillo unas células de eucariotas transformadas con éxito, en particular las de algas tales como H. pluvialis.
El problema planteado por esta misión lo resuelve el invento por medio de un vector, que comprende (a) una secuencia de ADN, que codifica la proteína fitoeno desaturasa, que posee en una posición una sustitución de aminoácidos, la cual confiere una resistencia frente a herbicidas, y (b) un sitio de clonación múltiple, en el que se puede introducir por clonación una secuencia arbitraria de ADN, realizándose que la secuencia de ADN que...
Reivindicaciones:
1. Un vector que comprende
2. Vector de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el vector posee una secuencia de ADN (a), que confiere a los transformantes una resistencia frente a herbicidas.
3. Vector de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque el vector posee una secuencia de ADN (a), que confiere a los transformantes una resistencia frente a herbicidas blanqueadores.
4. Vector de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado porque el herbicida blanqueador es norflurazona.
5. Vector de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 4, caracterizado porque posee la secuencia de ADN SEQ ID NO:5.
6. Vector de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 5, caracterizado porque la secuencia ADN arbitraria, que debe de ser introducida por clonación en el MCS, es una secuencia codificadora.
7. Vector de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque la secuencia codificadora es de procedencia vegetal.
8. Vector de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado porque la secuencia codificadora contiene por lo menos una secuencia de un promotor.
9. Vector de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque las secuencias de promotores se escogen entre el conjunto que se compone de los promotores de Haematococcus del gen de actina y del gen de Rubisco.
10. Vector de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 9, caracterizado porque la secuencia codificadora, junto a por lo menos un gen de promotor, contiene un gen funcional que se ha de expresar.
11. Vector de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado porque la secuencia codificadora se escoge entre el conjunto que se compone de los genes para la biosíntesis de carotenoides, los genes para la biosíntesis de astaxantina y los genes para la biosíntesis de isoprenoides.
12. Vector de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 11, caracterizado porque el vector se produce a partir de un vector obtenible libremente.
13. Utilización de un vector de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 12 para la transformación de células eucarióticas.
14. Utilización de acuerdo con la reivindicación 13 para la transformación de células de plantas unicelulares.
15. Utilización de acuerdo con la reivindicación 13 ó 14 para la transformación de células de algas.
16. Utilización de acuerdo con la reivindicación 15 para la transformación de células de H. pluvialis.
17. Utilización del vector de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 12 como marcador selectivo para la transformación.
18. Utilización del vector de acuerdo con la reivindicación 17 como marcador selectivo dominante para la transformación.
19. Procedimiento para realizar una transformación, caracterizado porque se utiliza un vector de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 12.
20. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 19, caracterizado porque la transformación se lleva a cabo mediante un bombardeo con partículas.
21. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 19 o 20, caracterizado porque el bombardeo con partículas se lleva a cabo con unas partículas de wolframio, que tienen un tamaño de 0,4-1,7 μm, a una presión de 500-2.500 psi y en vacío.
22. Célula de planta transgénica y sus descendientes, caracterizada/os porque contiene(n) un vector de acuerdo con la reivindicación 1 en su genoma nuclear.
23. Célula de planta transgénica y sus descendientes de acuerdo con la reivindicación 22, caracterizada/os porque tiene(n) una incorporación simple o múltiple del ADN introducido en el genoma nuclear.
24. Célula de planta transgénica y sus descendientes de acuerdo con una de las reivindicaciones 22 y 23, caracterizada/os porque el gen introducido es expresado constitutivamente.
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