BIOSENSOR AMPEROMETRICO DESECHABLE, METODO DE FABRICACION DEL MISMO YMETODO DE DETERMINACION DE LA PRESENCIA DE ANALITOS EN ALIMENTOS.
Biosensor amperométrico desechable (100), método de fabricación del mismo y método de determinación de la presencia de analitos en alimentos,
que comprende, básicamente el uso de una fina capa de oro (3) depositada por sputtering en un electrodo
Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200802211.
Solicitante: INBEA BIOSENSORES, S.L.
Nacionalidad solicitante: España.
Provincia: MADRID.
Inventor/es: FERRERO MARTIN,FRANCISCO J., PINGARRON CARRAZON,JOSE MANUEL, REVIEJO GARCIA,ANGEL JULIO, MANSO LORENZO,JAVIER, VAZQUEZ DE PRADA,ANA, VICENTE GARCIA-ECHAVE,VALENTIN, GAMELLA CARBALLO,MARIA, CAMPUZANO RUIZ,SUSANA, VALLEDOR LLOPIS,MARTA, CAMPO RODRIGUEZ,JUAN.
Fecha de Solicitud: 24 de Julio de 2008.
Fecha de Publicación: .
Fecha de Concesión: 2 de Febrero de 2011.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12Q1/00B
- G01N27/49B
Clasificación PCT:
- C12Q1/00 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones.
- G01N27/327 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 27/00 Investigación o análisis de materiales mediante el empleo de medios eléctricos, electroquímicos o magnéticos (G01N 3/00 - G01N 25/00 tienen prioridad; medida o ensayo de variables eléctricas o magnéticas o de las propiedades eléctricas o magnéticas de los materiales G01R). › Electrodos bioquímicos.
- G01N27/49 G01N 27/00 […] › Sistemas que implican la fijación de la corriente en un valor único específico, o en un pequeño margen de valores, para una tensión aplicada, con el fin de producir la medida selectiva de una o varias especies iónicas particulares.
Fragmento de la descripción:
Biosensor amperométrico desechable, método de fabricación del mismo y método de determinación de la presencia de analitos en alimentos.
Objeto de la invención
El objeto de la presente memoria descriptiva está referido a un biosensor amperométrico desechable para la determinación de, por ejemplo, fructosa en todo tipo de alimentos que contengan el analito a detectar.
Antecedentes de la invención
Se han construido biosensores de fructosa utilizando diferentes estrategias de inmovilización de la FDH: adsorción sobre partículas de oro coloidales que se depositan posteriormente sobre el electrodo de carbono vitrificado [Yabuki, S.; Mizutani, F. Electroanalysis 9 (1997) 23-25]; incorporación de la enzima en electrodos de pasta de carbono [Parellada, J.; Domínguez, E.; Fernández, V.M. Anal. Chim. Acta 330 (1996) 71-77], [Paredes, P.A.; Parellada, J.; Fernández, V.M.; Katakis, I.; Domínguez, E. Biosens. & Bioelectron. 12 (1997) 1233-1243]; encapsulamiento de la enzima en membranas depositadas sobre el electrodo [Xie, X.; Kuan, S.S.; Guilbault, G.G. Biosens. & Bioelectron. 6 (1991) 49-54], [Ikeda, T.; Matsushita, F.; Senda, M. Biosens. & Bioelectron. 6 (1991) 299-304], [Antiochia, R.; Palleschi, G. Anal. Lett. 30 (1997) 683-697], [Tká
Chim. Acta 281 (1993) 527-533], [Swann, M.J.; Bloor, D.; Haruyama, T.; Aizawa, M. Biosens. & Bioelectron. 12 (1997) 1169-1182], [García, C.A.B.; de Oliveira Neto, G.; Kubota, L.T. Anal. Chim. Acta 374 (1998) 201-208] y no conductoras [Bassi, A.S.; Lee, E.; Zhu, J.-X. Food Research International 31 (1998) 119-127]; inmovilización en sílica-gel [García, C.A.B.; de Oliveira Neto, G.; Kubota, L.T.; Grandin, L.A. J. Electroanal. Chem. 418 (1996) 147-151]; adsorción sobre bicapas de fosfolípidos [Kinnear, K.T.; Monbouquette, H.G. Anal. Chem. 69 (1997) 1771-1775]; adsorción sobre monocapas autoensambladas de ODTNB [Darder, 20Darder, M.; Casero, E.; Pariente, F.; Lorenzo, E. Anal. Chem. 72 (2000) 3784-3792] e inmovilización mediante enlace covalente con glutaraldehído sobre una monocapa de cistamina [Watanabe, S.; Kubo, I. Electrochem. 70 (2002) 258-263].
En general, en cuanto a la estabilidad de los biosensores, aquellos que se han construido utilizando un método de inmovilización sencillo, como la adsorción directa sobre electrodos metálicos o de carbono ([Yabuki, S.; Mizutani, F. Electroanalysis 9 (1997) 23-25], [Begum, A.; Kobatake, E.; Suzawa, T.; Ikariyama, Y.; Aizawa, M. Anal. Chim. Acta 280 (1993) 31-36]), suelen presentar tan baja estabilidad que su aplicación a la determinación de fructosa en muestras reales no es posible. El biosensor en el que la enzima se ha inmovilizado en bicapas de fosfolípidos depositadas sobre el electrodo, presenta mayor estabilidad [Kinnear, K.T.; Monbouquette, H.G. Anal. Chem. 69 (1997) 1771-1775], pero la etapa de inmovilización suele ser excesivamente larga, requiriendo procesos de diálisis de varios días de duración (2-6 días). Los mejores resultados se han logrado con biosensores fabricados por modificación de pasta de carbono con la enzima [Ikeda, T.; Matsushita, F.; Senda, M. Biosens. & Bioelectron. 6 (1991) 299-304], [Paredes, P.A.; Parellada, J.; Fernández, V.M.; Katakis, I.; Domínguez, E. Biosens. & Bioelectron. 12 (1997) 1233-1243], Estos dispositivos se pueden utilizar durante unos 7-15 días, con respuestas del orden del 30-50% de la intensidad inicial. Sin embargo, como todos los biosensores desarrollados sobre pasta de carbono, presentan los inconvenientes de requerir un gasto de enzima elevado y de proporcionar una mala reproducibilidad.
También se ha desarrollado un biosensor de fructosa deshidrogenasa que mejora los anteriores en el que se produce la coinmovilización de la enzima FDH y el mediador redox TTF mediante entrecruzamiento con glutaraldehído sobre un electrodo de oro convencional modificado con una monocapa de ácido mercaptopropiónico (MPA) [Campuzano, O.A. Loaiza, M. Pedrero, F. J. Manuel de Villena, J. M, Pingarrón, Bioelectrochemistry 63 (2004) 199-206], esta monocapa es necesaria para separar la superficie del electrodo de oro de la enzima para que no se produzca la desactivación de la FDH. Con este biosensor se consiguen tiempos de operatividad de más dé 30 días y se pueden realizar más de 150 análisis con el mismo biosensor. Sin embargo, el tiempo requerido para su fabricación es de más de un día, debido a que es necesario este tiempo para depositar la monocapa de MPA necesaria para que no se produzca la desactivación de la enzima.
El oro depositado sobre la superficie de acero inoxidable mediante sputtering tiene una estructura diferente a la del electrodo de oro convencional que no produce la desactivación de la enzima y por tanto no es necesaria la modificación con monocapas de MPA del oro depositado sobre la superficie del electrodo de acero inoxidable. Además el electrodo de acero inoxidable recubierto con oro mantiene todas las demás característica del electrodo de oro convencional en aplicaciones electroquímicas.
El recubrimiento de cristales de cuarzo con oro mediante sputtering es una técnica usual en la construcción de biosensores piezoeléctricos. Recientemente también ha sido empleada en la construcción de biosensores electroquímicos principalmente en forma de pistas sobre materiales no conductores poliméricos o sobre otros metales previamente depositados sobre superficies poliméricas como Cr igual que se hace en la construcción de los cristales piezoeléctricos. Se han construido biosensores con oro depositado por sputtering para la construcción de biosensores enzimáticos [Masatoshi Hashimoto, Sanjay Upadhyay, Hiroaki Suzuki, Biosensors and Bioelectronics 21 (2006) 2224-2231; Huaqing Li, Zonghui Guoa, Hui Wang, Dafu Cui, Xinxia Cai; Sensors and Actuators B 119 (2006) 419-424] e inmunosensores [Eva M. Abad-Villar, M. Teresa Fernández-Abedul, Agustiín Costa-García, Biosensors and Bioelectronics 17 (2002) 797-780; Eva M. Abad-Villar, M. Teresa Fernández-Abedul, Agustiín Costa-García, Analytica Chimica Acta 453 (2002) 63-69] que necesitan modificar la superficie de oro para conseguir una buena estabilidad del biosensor.
Descripción de la invención
Ninguno de los biosensores electroquímicos mencionados anteriormente, se han construido por deposición de oro mediante sputtering sobre superficies de metales como acero inoxidable. La deposición de oro sobre acero inoxidable por sputtering es sencilla y económica para construir electrodos (biosensores) de oro, ya que mediante dicha deposición se inmoviliza la enzima directamente sobre la superficie del electrodo sin que haya una desactivación de la enzima como se ha comentado anteriormente.
La presente invención está referida a un electrodo enzimático desechable para la determinación, preferentemente de fructosa, en todo tipo de alimentos que contengan este analito. De forma más concreta, el biosensor consiste en una matriz electrónica de acero inoxidable o cualquier otro material conductor embebido en un material aislante en el que se ha depositado una película de oro mediante la técnica de "sputtering" sobre una de las superficies de la matriz electródica, estando la otra superficie en contacto con el potenciostato. Sobre la película de oro se deposita la enzima correspondiente con el mediador adecuado y se encapsula con una membrana de diálisis.
Es un segundo aspecto de la presente invención, el procedimiento para la determinación de la presencia de analitos en alimentos, particularmente fructosa, mediante la medida de la señal amperométrica obtenida de la monitorización del analito en una disolución de trabajo a la que se le ha añadido una alícuota de la muestra.
Este método se basa en el empleo de un dispositivo que comprende el biosensor objeto de la invención, junto con un electrodo de referencia de Ag/AgCl y un electrodo auxiliar de un material conductor. Este dispositivo está sumergido en una disolución de trabajo a la que se añade una alícuota de la muestra del alimento. El biosensor está conectado a un instrumento que además de utilizarse como potenciostato permite,...
Reivindicaciones:
1. Biosensor amperométrico desechable (100) caracterizado porque comprende:
un cuerpo conductor (1) con un eje longitudinal sobre el que se sitúa un dispositivo de reconocimiento individual de cada biosensor amperométrico desechable (7) configurado para que el instrumento de medida realice un cuenteo del número de medidas;
un cuerpo aislante (2) con un eje longitudinal, situado de manera coaxial sobre el cuerpo conductor (1) de tal forma que dicho cuerpo conductor (1) quede parcialmente rodeado a lo largo de su eje longitudinal por el cuerpo aislante (2);
y donde, sobre la base (12) del extremo del cuerpo conductor (1) rodeado coaxialmente por el cuerpo aislante (2) se sitúan, al menos:
una capa de oro (3) depositada por sputtering, sobre la que se deposita una capa de enzima (4) correspondiente con el mediador adecuado;
estando encapsulada, la base (12) con la capa de oro (3) y la capa de enzima (4), con una membrana permeable al analito (5) cerrada con un anillo (6).
2. Procedimiento de fabricación del biosensor amperométrico desechable (100) de la reivindicación 1 caracterizado porque comprende, las siguientes etapas:
(i) una primera etapa de colocación de una capa de oro (3) por sputtering sobre la base (12) de un material conductor (1) parcialmente rodeado a lo largo de su eje longitudinal por un material aislante (2);
(ii) una segunda etapa de colocación de la enzima (4) adecuada en disolución, secándose dicha disolución y adicionando una alícuota con la cantidad adecuada de mediador, secando la solución en conjunto; y
(iii) una tercera etapa de colocación de una membrana de diálisis (5) u otra membrana permeable al analito sobre la superficie del conjunto formado por la enzima (4) y el mediador junto con el oro (3).
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