MEDICION DE ANALITO.

Un método para determinar la concentración de un analito en una muestra que comprende poner en contacto la muestra con un micro electrodo que comprende una enzima capaz de reaccionar con dicho analito y un mediador redox que es capaz de convertirse estando oxidado o reducido por dicha enzima una vez que esta última ha reaccionado con el analito,

en el que dicha enzima y dicho mediador están presentes típicamente en exceso en comparación con dicho analito, permitiendo que el analito reaccione con la enzima, reaccionando dicha enzima substancialmente por completo con dicho analito antes de aplicar un potencial, aplicando después un potencial a través del electrodo y midiendo la concentración resultante del mediador convertido electroquímicamente

Medición de analito.

Esta invención se refiere a un método para determinar la concentración de un analito de una muestra y, en particular, a un método para determinar la concentración electroquímicamente.

Es particularmente valioso para determinar la concentración de un componente específico en una muestra que es de origen biológico, por ejemplo sangre. Para este propósito se usa un biosensor; se hace uso de un cambio en el estado de oxidación de un mediador que interacciona con una enzima que ha reaccionado con el analito a determinar. El estado de oxidación del mediador se elige de modo que éste se encuentre en el estado en el que únicamente interaccionará con la enzima sobre la adición del sustrato. El analito reacciona con una concentración estequiomérica del mediador mediante la enzima. Esto hace que el mediador se oxide o se reduzca (dependiendo de la reacción enzimática) y este cambio a nivel del mediador puede medirse determinando la corriente generada a un potencial determinado.

Normalmente, se toma una medición de la oxidación (o reducción) del mediador por la enzima, ya que esta reacciona con el analito. Esto puede, sin embargo, dar lugar a resultados poco fiables. Se ha propuesto, por lo tanto, esperar que la reacción finalice y después tomar una medición. Sin embargo, el valor obtenido cambia con el tiempo de manera que generalmente es necesario tomar una serie de lecturas y luego determinar la concentración usando un algoritmo o por la integración del área bajo la curva que es propia del gráfico de los valores. Este cambio en el valor es causado por el efecto de difusión que se produce esencialmente de manera lineal a partir del electrodo. De esta manera como algo del mediador se oxida (o reduce) en el electrodo se difunde más mediador hacia el electrodo en una base permanente. Sin embargo, esta difusión lineal produce el agotamiento del material electro activo alrededor del electrodo de trabajo.

Con el fin de determinar la concentración es necesario obtener en primer lugar un valor en ausencia del analito y restar este valor "de fondo" del valor mejorado que se obtiene cuando el analito está presente. Se apreciará que este procedimiento es complicado y propenso a errores.

Recientemente, se han tomado medidas para reducir el tamaño de los biosensores mediante el uso de un micro electrodo. Esto puede definirse como un electrodo en el que al menos una de la dimensiones no supera las 50 µm y con frecuencia es de 1 a 25 ó 30 µm.

Los micro electrodos se concibieron porque se observó que mejoraban la medición de corrientes muy pequeñas. Esto es debido al uso de un conjunto de micro electrodos que proporciona una mejor relación de señal con respecto a interferencia que la proporcionada por un solo electrodo. Por lo tanto los micro electrodos se concibieron para la determinación de corriente continua y no han encontrado utilidad como biosensores que impliquen una enzima y un mediador. Sin embargo, sorprendentemente se ha descubierto que el uso de un micro electrodo puede, si se usa de una manera particular, superar las desventajas de los macro electrodos.

Estos micro electrodos pueden usarse con este fin son particularmente sorprendentes por dos razones principales. En primer lugar, la potenciación de la corriente debido a la presencia del analito sobre el nivel de fondo para un micro electrodo es por supuesto mucho más pequeña que para un macro electrodo. Por consiguiente con la disminución del tamaño, es imposible obtener mediciones precisas. En segundo lugar, como el área del electrodo es muy pequeña en relación al volumen de la muestra la difusión hacia la superficie del electrodo ya no tiene lugar linealmente como en el macro electrodo sino, en su lugar, radialmente. La distancia a través de la cual se produce la reacción en solución es grande comparada con el tamaño de los micro electrodos de tal manera que podría esperarse que haya poca o ninguna mejora catalítica. Por lo tanto podría esperarse que con la disminución del tamaño del electrodo no pueda obtenerse ninguna medida significativa.

En condiciones normales de estado continuo, la distancia media que el estado oxidado del mediador difundirá antes de que reaccione para cambiar al estado reducido será (Dt_L)^1/2 en la que D es el coeficiente de difusión del estado oxidado y t_L es la semi vida de la reacción antes de que cambie el estado oxidado. Se apreciará que como el tamaño del micro electrodo es pequeño en comparación con la distancia de difusión, normalmente hay muy poca mejora de la corriente en presencia de la reacción catalítica. En otras palabras, la presencia del analito que promueve la reacción catalítica conduce únicamente a un pequeño aumento de corriente por encima de la inicialmente presente. La pequeña magnitud de esta "corriente de perturbación" significa por tanto que no pueden obtenerse resultados analíticos precisos.

A pesar de estos inconvenientes significativos se ha descubierto sorprendentemente que si la determinación se realiza después de que la reacción haya tenido lugar, la forma de la curva de potencial después de un máximo inicial es sustancialmente horizontal, con el resultado de que, en primer lugar, puede obtenerse una medición directa sin necesidad de restar el valor de fondo y que, en segundo lugar, sólo se necesita una medición. La Figura 1 ilustra una curva típica que puede obtenerse. En otras palabras, la concentración puede determinarse directamente a partir de un valor único.

De acuerdo con la presente invención se proporciona un método para determinar la concentración de un analito en una muestra que comprende poner en contacto la muestra con un micro electrodo que comprende una enzima capaz de reaccionar con dicho analito y un mediador redox que es capaz de convertirse estando oxidado o reducido por dicha enzima una vez que esta última ha reaccionado con el analito, en el que dicha enzima y dicho medidor están típicamente presentes en exceso en comparación con dicho analito, permitiendo que el analito reaccione con la enzima, reaccionando sustancialmente dicha enzima por completo con dicho analito antes de aplicar un potencial, aplicando después un potencial a través de electrodo, y midiendo la concentración resultante del mediador convertido electroquímicamente. Típicamente, la corriente resultante puede medirse y determinarse la concentración directamente por comparación con un conjunto de datos de referencia almacenados. La corriente catalítica se genera ya que la enzima renueva continuamente el sustrato y la enzima se reutiliza continuamente. De acuerdo con la presente invención, la reacción finaliza o alcanza un estado de equilibrio estable que puede ser menor del 100% de conversión y puede ser tan bajo como, por ejemplo, el 50% de conversión antes de que se aplique el potencial; el estímulo para finalizar la reacción surge del gran exceso de la enzima en este sistema - muchos órdenes de magnitud superiores al del sistema catalítico.

Deberá apreciarse que con una reacción de un método de este tipo dentro del mediador que ocurre en toda la solución, el mediador reacciona con la enzima y cuando se aplica el voltaje el mediador oxidado/reducido resultante se reduce/oxida a su estado de oxidación original en el electrodo. Esto contrasta con un sistema catalítico en el que el mediador se oxida/reduce y este después reacciona con la enzima - se obtiene una cantidad catalítica con un nivel reducido de enzima en toda la solución debido a la renovación continuada. De ello se deduce que en el sistema de la presente invención la enzima debe estar en exceso en el conjunto de la solución que se ensaya. En cambio en el sistema catalítico normal como la reacción se limita a la solución adyacente a la superficie del electrodo, la mayor parte de la solución de ensayo es imperturbable por la reacción enzimática. Debe observarse que este requisito no significa necesariamente que la enzima deba ser homogénea a través de la mezcla. Prácticamente se ha comprobado que convendría el exceso de enzima de manera que el tiempo de reacción predicho sea de un orden de magnitud inferior al tiempo de medición aceptable para el sensor. Por lo tanto la cantidad de enzima necesaria secada en una tira (que estará relacionada con el tiempo de funcionamiento-humedad) se estipulará por el tiempo de respuesta necesario, la velocidad de re-suspensión de la enzima junto con la cantidad de actividad retenida por la enzima, el volumen en el que se esta finalizando el ensayo y la concentración máxima del analito a ensayar. Es evidente que estos parámetros variarán de ensayo a ensayo y de enzima...

1. Un método para determinar la concentración de un analito en una muestra que comprende poner en contacto la muestra con un micro electrodo que comprende una enzima capaz de reaccionar con dicho analito y un mediador redox que es capaz de convertirse estando oxidado o reducido por dicha enzima una vez que esta última ha reaccionado con el analito, en el que dicha enzima y dicho mediador están presentes típicamente en exceso en comparación con dicho analito, permitiendo que el analito reaccione con la enzima, reaccionando dicha enzima substancialmente por completo con dicho analito antes de aplicar un potencial, aplicando después un potencial a través del electrodo y midiendo la concentración resultante del mediador convertido electroquímicamente.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1 en el que la concentración resultante se mide a partir de la corriente resultante.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 en el que el micro electrodo comprende un electrodo de trabajo, un contra electrodo y un electrodo de referencia.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3 en el que el contra electrodo y el electrodo de referencia están combinados.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4 en el que el electrodo de trabajo está fabricado con paladio, platino, oro o carbono y el contra electrodo está fabricado con carbono, Ag/AgCl, Ag/Ag₂SO₄, paladio, oro, platino, Cu/CuSO₄, Hg/HgO, Hg/HgCl₂, Hg/HgSO₄, o Zu/ZuSO₄.

6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el mediador es ferricianida, fenazina etosulfato, fenazina metosulfato, 1-metoxi fenazina metosulfato, fenileno diamina o rutenio hexamina.

7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la enzima es glucosa deshidrogenasa, colesterol esterase, peroxidasa de rábano picante, colesterol deshidrogenasa, colesterol oxidasa, lipoproteína lipasa, glicerol quinasa, glicerol deshidrogenasa, glicerol-3-fosfato oxidasa, lactato oxidasa o lactato deshidrogenasa.

8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende dejar transcurrir un tiempo de 0,5 a 180 segundos después de haber aplicado la muestra al micro electrodo antes de aplicar un potencial a través del electrodo y realizar una medición electroquímica no superior a 5 segundos después.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 8 en el que el potencial aplicado es de -2 a +2 voltios.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 8 ó 9 en el que la medición se realiza de 10 a 500 milisegundos después de haber aplicado el potencial.

11. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 en el que se toman de 10 a 100 mediciones.

12. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el micro electrodo se ha calibrado previamente para proporcionar una lectura directa.

13. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el mediador está presente en exceso con respecto al analito.

14. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el mediador que ha reaccionado está presente a una concentración correspondiente a una proporción de electrones 1:1 con el analito.

15. Un método para determinar la concentración de un analito en una muestra que comprende poner en contacto la muestra con un micro electrodo que contiene una enzima capaz de reaccionar con dicho analito y un mediador redox que es capaz de convertirse estando oxidado o reducido por dicha enzima una vez que esta última ha reaccionado con el analito, en el que dicha enzima y dicho mediador están presentes típicamente en exceso en comparación con dicho analito, dejar que el analito reaccione con la enzima, aplicar después un potencial a través del electrodo, medir la corriente resultante, invertir el potencial y medir de nuevo la corriente, expresar las dos corrientes como la proporción o porcentaje y determinar la concentración del analito directamente a partir de esto.

16. El método de acuerdo con la reivindicación 15 que comprende dejar transcurrir un tiempo de 0,5 a 180 segundos después de haber aplicado la muestra al micro electrodo antes de aplicar un potencial a través del electrodo y realizar una medición electroquímica no superior a 5 segundos después de esto.

17. El método de acuerdo con la reivindicación 15 o 16 en el que el potencial aplicado es de -2 a +2 voltios.

18. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17 en el que el mediador está presente en exceso con respecto al analito.