BETA-GLUCANASAS DE TALAROMYCES EMERSONII.

La presente invención se relaciona con (ß-)glucanasas novedosas (y también con celulasas) del hongo Talaromyces, en particular Talaromyces emersonii, y su uso en la degradación del glucano en celulosa. Antecedente de la Invención La composición de la pared celular de una planta es compleja y variable. Los polisacáridos se encuentran principalmente en la forma de cadenas largas de celulosa (el componente estructural principal de la pared celular de la planta), hemicelulosa (que comprende varias cadenas ß-xilano, tal como xiloglucanos) y pectina. El beta- glucano (o, más apropiadamente, (13)(14)ß-D-glucano), PM de 10 a 14 kDa, es un componente de hemicelulosa de planta (PM de aproximadamente 700 kDa) y consiste de una estructura de residuos de glucopiranosa ligados a ß-1,4 y 1,3. Otro componente es xilano que consiste de residuos xilosa ligados ß-1,4, opcionalmente sustituidos con cadenas laterales tal como arabinosa y/o residuos de ácido glucurónico. Existen diferencias básicas entre las monocotiledóneas (por ejemplo cereales y grasas) y dicotiledóneas (por ejemplo trébol, colza y soya) y entre la semilla y las partes del vegetal de las plantas Monocotiledóneas se caracterizan por la presencia de un complejo arabinoxilano como la estructura hemicelulosa principal, y la estructura principal de la hemicelulosa en las dicotiledóneas es un complejo xiloglucano. Se encuentran concentraciones mayores de pectina en las dicotiledóneas que en las monocotiledóneas. Las semillas son generalmente ricas en sustancias pecticas pero relativamente pobres en material celulósico. Se utilizan enzimas que degradan la celulosa para el procesamiento del material de planta en el alimento así como también aplicaciones alimenticias o como un alimento o aditivo alimenticio debido a su capacidad de actuar en los sustituyentes principales de la pared celular de la planta. La mayor parte de las enzimas que degradan la celulosa disponibles en la industria parecen ser glucanasas con un peso molecular relativamente bajo y una estabilidad moderada a altas temperaturas. MOLONEY A. P. et al. (BIOCHEMICAL JOURNAL, Vol. 225, No. 2, 1985, páginas 365-374) describe cuatro endo- Glucanasas de T. emersonii que muestran una actividad óptima en un pH de 5,5 a 5,8 y a una temperatura de 75 °C a 80 °C. Sin embargo, para ciertas aplicaciones es deseable utilizar una glucanasa con una termoestabilidad relativamente alta. Si se va a utilizar una glucanasa como un aditivo para alimento de animal entonces se prefiere una alta termoestabilidad debido a que se aplican alta temperatura durante la peletización del alimento del animal. Resumen de la Invención Ahora se proporcionan ß-glucanasas novedosas (o celulasas) que son capaces de dividir el ß-D-glucano (o celulosa) tal como está presente en el material de planta. Se proporciona un polipéptido, que es una ß-glucanasa que se puede obtener de un hongo del género Talaromyces, tal como el hongo Talaromyces emersonii, que tiene la actividad EC 3.2.1.4 (actividad endoglucanasa), que comprende: (i) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID No. 4; o ES 2 366 122 T3 (ii) una variante de (i) que es capaz de dividir el ß-D-glucano que tiene por lo menos 80 % de identidad sobre la longitud completa para la secuencia de aminoácido de la SEQ ID No. 4; o (iii) un fragmento de (i) o (ii) que es capaz de dividir ß-D-glucano. 2 En su sentido más amplio, la invención se relaciona con ß-glucanasas (o celulasas) de Talaromyces, tal como Talaromyces emersonii (un hongo). Estas ß-glucanasas pueden dividir el ß-D-glucano o celulosa, por ejemplo ellos son ß-1,4-endoglucanasas, o tienen la actividad EC 3.2.1.4. Las glucanasas pueden tener: a. un pH óptimo por debajo de 7.0 o 5.4, tal como por debajo de 5.0, por ejemplo de 4.4 a 5.2 o de 3.0 a 6.0 o 7.0; o b. una temperatura óptima de por lo menos 72°C, 75°C o incluso 81°C, tal como de 78°C a 85°C o de 83°C a 87°C. Más específicamente, la presente invención proporciona un polipéptido (aislado) ß-glucanasa que comprende: la secuencia de aminoácido de la SEQ ID No 4, o (ii) una variante de (i) que es capaz de dividir ß-D-glucano; o (iii) un fragmento de (i) o (ii) que es capaz de dividir el ß-D-glucano De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporciona un polinucleótido que comprende: (a) la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID No. 3 o una secuencia que codifica un polipéptido de acuerdo con cualquier reivindicación precedente; (b) una secuencia que es complementaria a, o que hibrida a, una secuencia como se define en (a) bajo condiciones rigurosas; (c) un fragmento de por lo menos 25 bp de la SEQ ID No. 3; (d) una secuencia que tiene por lo menos 80 % de identidad en una secuencia como se define en (a) o (b) ; o (e) una secuencia que se degenera como un resultado del código genético para una cualquiera de las secuencias como se define en (a) a (d) (f) una secuencia modificada de la SEQ ID No. 3 con hasta 100 sustituciones de nucleótido. La invención también proporciona: - un vector (por ejemplo de expresión) que comprende un polinucleótido de la invención y que puede ser capaz de expresar un polipéptido de la invención; - una estirpe celular o cepa que comprende un vector de la invención; - un método para producir un polipéptido de la invención cuyo método comprende mantener una estirpe celular o cepa de la invención bajo condiciones adecuadas para obtener la expresión del polipéptido y, si es necesario, aislar el polipéptido; - un método para degradar ß-D-glucano, el método comprende poner en contacto un material que comprende el ß-Dglucano con un polipéptido de la invención; - un método para la identificación de un compuesto que modula la actividad ß-glucanasa, cuyo método comprende poner en contacto un polipéptido de la invención con un compuesto de prueba en la presencia del ß-D-glucano y monitorear o detectar cualquier modulación de la actividad; - un método para tratar un sujeto que tiene hiperlipemia cuyo método comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva del polipéptido de la invención; y - uso del polipéptido en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de hiperlipemia. Breve Descripción de las secuencias ES 2 366 122 T3 3 La SEQ ID No. 1 es una secuencia de ADN de una primera ß-glucanasa (CEA) de la invención de Talaromyces emersonii; La SEQ ID No. 2 es la secuencia de aminoácido de la primera ß-glucanasa, CEA; La SEQ ID No. 3 es una secuencia de ADN de una segunda ß-glucanasa (CEB) del mismo organismo; La SEQ ID No. 4 es la secuencia de aminoácido de la segunda ß-glucanasa, CEB; La SEQ ID No. 5 es una secuencia de ADN de una tercera ß-glucanasa (CEC) también del mismo organismo; La SEQ ID No. 6 es la secuencia de aminoácido de la tercera ß-glucanasa, CEC; y la SEQ ID Nos. 7 y 8 son cebadores PCR que hibridan a la SEQ ID No. 1 (y se utilizan para reclonar los insertos de cADN durante análisis genético de transformantes positivos). Descripción Detallada de la invención A. Polinucléotidos. La presente invención proporciona un polinucléotido (por ejemplo aislado y/o purificado) que codifica los polipéptidos de la invención. La presente invención así proporciona un polinucleótido que codifica una ß-glucanasa cuya secuencia de aminoácido se establece en la SEQ ID No. 4. La presente invención proporciona adicionalmente un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene homología de la secuencia de aminoácido sustancial a la secuencia de aminoácido establecida en la SEQ ID No. 4, también se incluye un polinucleótido seleccionado de: (a) un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótido establecida en la SEQ ID No. 3, o el complemento de la misma; (b) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótido capaz de (por ejemplo selectivamente) hibridar a una secuencia de nucleótido establecida en la SEQ ID No. 3, o un fragmento de la misma; (c) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótido capaz de (por ejemplo selectivamente) hibridar al complemento de la secuencia de nucleótido establecida en la SEQ ID No. 3, o un fragmento de la misma; y/o (d) un polinucleótido que comprende una secuencia de polinucleótido que se degenera como un resultado del código genético a un polinucleótido definido en (a), (b) o (c). Un polinucleótido de la invención también incluye un polinucleótido que: (a) codifica un polipéptido que tiene actividad ß-glucanasa, cuyo polinucléotido es: (1) la secuencia de codificación de la SEQ ID No. 3; (2) una secuencia que hibrida selectivamente al complemento de la secuencia definido en (1); o (3) una secuencia que se degenera como un resultado del código genético con respecto a una secuencia definida en (1) o (2); o (b) es una secuencia complementaria a un polinucleótido definido en (a). Secuencias hibridables ES 2 366 122 T3 El término "capaz de... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido, que es una ß-glucanasa que se puede obtener de un hongo del género Talaromyces, tal como el hongo Talaromyces emersonii, que tiene la actividad EC 3.2.1.4 (actividad endoglucanasa), que comprende: (i) la secuencia de aminoácido de la SEQ ID No. 4; o (ii) una variante de (i) que es capaz de dividir el ß-D-glucano que tiene por lo menos 80 % de identidad sobre la longitud completa para la secuencia de aminoácido de la SEQ ID No. 4; o (iii) un fragmento de (i) o (ii) que es capaz de dividir el ß-D-glucano. 2. El polipéptido de acuerdo con la Reivindicación 1 en donde la variante (ii) tiene por lo menos 85 % de identidad sobre la longitud completa para la secuencia de aminoácido de la SEQ ID No. 4 y/o el fragmento de (iii) tiene por lo menos 150 aminoácidos contiguos de longitud. 3. El polipéptido de acuerdo con la Reivindicación 1 o 2, que tiene un pH óptimo por debajo de 5.4 o una temperatura óptima de >75 °C. 4. Un polinucleótido que comprende: ES 2 366 122 T3 (a) la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID No. 3 o una secuencia que codifica un polipéptido de acuerdo con cualquier reivindicación precedente; (b) una secuencia que es complementaria a, o que hibrida a, una secuencia como se define en (a) bajo condiciones rigurosas; (c) un fragmento de por lo menos 25 bp de la SEQ ID No. 3; (d) una secuencia que tiene por lo menos 80%, identidad en una secuencia como se define en (a) o (b) ; o (e) una secuencia que se degenera como un resultado del código genético para una cualquiera de las secuencias como se define en (a) a (d) (f) una secuencia modificada de la SEQ ID No. 3 con hasta 100 sustituciones de nucleótido. 5. El polinucleótido de acuerdo con la Reivindicación 4 en donde la secuencia codifica un polipéptido que tiene actividad ß-glucanasa. 6. El polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 4 a 5, que es una secuencia de ADN. 7. Un vector que comprende una secuencia de polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 4 a 6. 8. El vector de acuerdo con la Reivindicación 7, que es un vector de expresión, tal como cuando una secuencia de ADN de acuerdo con la Reivindicación 6 se liga operablemente a una secuencias reguladora. 9. Una célula anfitriona, que comprende, como una secuencia heteróloga, un polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 4 a 7. 10. Una célula anfitriona, que expresa, como una proteína heteróloga, un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3. 11. Una célula anfitriona transformada con la secuencia de ADN de la Reivindicación 6 como una secuencia heteróloga o un vector de la Reivindicación 8. 12. Un proceso para producir un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3, el proceso comprende cultivar una célula anfitriona como se define en cualquiera de las Reivindicaciones 9 a 11 bajo condiciones que proporcionan la expresión del polipéptido. 13. El uso de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3 para la fabricación de un medicamento para tratar hiperlipemia y/o altos niveles de triglicéridos y colesterol en suero en un individuo o un trastorno que resulta del mismo. 48 ES 2 366 122 T3 14. Un método para identificar un compuesto que modula la actividad ß-glucanasa, el método comprende poner en contacto un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 o 3 con un compuesto de prueba y monitorear la actividad ß-glucanasa. 15. Un método para tratar material de planta, el método comprende poner en contacto el material de planta con un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3. 16. Un método de acuerdo con la Reivindicación 15 en donde el tratamiento comprende degradar o modificar la celulosa, tal como ß- glucano, en el material de planta. 17. Un método de acuerdo con la Reivindicación 16 para degradar o modificar las paredes celulares de la planta. 18. Un método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 15 a 17 en donde el tratamiento comprende la división de las subunidades de glucosa de un componente ß-D-glucano del material. 19. Un método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 15 a 17 en donde el material comprende una planta, pulpa de planta, extracto de planta o un alimento comestible o ingrediente del mismo, o una tela, textil o prenda que contiene el material de planta. 20. Un método para reducir la viscosidad de un material de planta, el método comprende poner en contacto el material de planta con un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3 en una cantidad y bajo condiciones efectivas para degradar la celulosa contenida en el material. 21. Uso de un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3 en un método para tratar el material de planta. 22. Uso de acuerdo con la Reivindicación 21 en donde el tratamiento comprende dividir los polímeros ß-D-glucano en el material de planta. 23. Uso de un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3 en un método para procesar pulpa de planta, jugo o extracto cuyo método comprende incubar la pulpa, jugo o extracto con el polipéptido o composición por lo menos para degradar parcialmente la celulosa. 24. Uso de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3 en fabricación de cerveza, destilación, biometanación, higiene dental, tratamiento de cuero, fabricación de papel, tratamiento o fabricación textil, panadería o elaboración de pan, lavado o tratamiento con detergente, tratar bulbos de lores o en el alimento de un animal. 25. Un alimento o producto alimenticio que comprende un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3. 26. Un alimento o producto alimenticio de acuerdo con la Reivindicación 25, que es una bebida alcohólica, pan, masa o te. 27. Un organismo de planta transgénica que comprende una célula de acuerdo con la Reivindicación 10 u 11. 49