Una composición que comprende un ARN interferente pequeño (ARNip) de ZNFN3A1 para su uso en tratar un tumor caracterizado por la sobreexpresión de ZNFN3A1 en un sujeto,

en donde dicho ARNip comprende un ácido nucleico ZNFN3A1 sentido y un ácido nucleico ZNFN3A1 antisentido, y en donde dicho ARNip es específico para una diana de ZNFN3A1 seleccionada del grupo que consiste en los nucleótidos 451-471, 532552, 623-643, 625-645, 636-656, 726-746, 923-943, 1065-1085 y 1258-1278 de SEQ ID NO:1, en donde dicho ARNip de ZNFN3A1 tiene entre 19 y 25 nucleótidos de longitud

Campo técnico

La presente invención se refiere al campo de la ciencia biológica, más específicamente al campo de investigación en cáncer. En particular, la presente invención se refiere a una composición que comprende un ARN interferente pequeño (ARNip) de ZNFN3A1.

Antecedentes técnicos

El carcinoma hepatocelular (CHC) está entre los cinco tipos más frecuentes de cánceres y es la cuarta causa principal de muerte por cáncer en el mundo. Aunque recientes avances médicos han hecho gran progreso en diagnosticar la enfermedad, un gran número de pacientes con CHC son aún diagnosticados en fases avanzadas. La mayoría de los pacientes no se curan por resección quirúrgica debido a la grave disfunción del hígado, tumores expandidos y/o múltiples, o alta incidencia de recaída. Por tanto el desarrollo de fármacos de gran eficacia quimioterapéutica y estrategias preventivas son asuntos de interés apremiante.

Divulgación de la invención

La presente invención se basa en el sorprendente descubrimiento de que ARN interferentes pequeños (ARNip) selectivos para ZNFN3A1 son eficaces para inhibir el crecimiento celular de varias células cancerosas, incluyendo las implicadas en CHC.

La invención proporciona métodos para inhibir el crecimiento celular. Entre los métodos proporcionados están los que comprenden poner en contacto una célula con una composición que comprende un ARN interferente pequeño (ARNip) de ZNFN3A1. La invención también proporciona métodos para inhibir el crecimiento de células tumorales. Tales métodos incluyen el uso de una composición que comprende un ARN interferente pequeño (ARNip) de ZNFN3A1. Otro aspecto de la invención proporciona métodos para inhibir la expresión del gen ZNFN3A1 en una célula de una muestra biológica. La expresión del gen se puede inhibir mediante la introducción de una molécula de ácido ribonucleico (ARN) bicatenario en la célula en una cantidad suficiente para inhibir la expresión del gen ZNFN3A1. Otro aspecto de la invención se refiere a productos que incluyen secuencias de ácido nucleico y vectores así como composiciones que los comprenden, útiles, por ejemplo, en los métodos proporcionados. Entre los productos proporcionados están moléculas de ARNip que tienen la propiedad de inhibir la expresión del gen ZNFN3A1 cuando se introducen en una célula que expresa dicho gen. Entre tales moléculas están las que comprenden una hebra sentido y una hebra antisentido, en donde la hebra sentido comprende una secuencia de ribonucleótidos que corresponde a una secuencia diana de ZNFN3A1, y en donde la hebra antisentido comprende una secuencia de ribonucleótidos que es complementaria a dicha hebra sentido. Las hebras sentido y antisentido de la molécula hibridan entre sí para formar una molécula bicatenaria.

Como se usa aquí el término “organismo” se refiere a cualquier entidad viva que comprende al menos una célula. Un organismo vivo puede ser tan simple como, por ejemplo, un única célula eucariota o tan complejo como un mamífero, incluyendo un ser humano.

Como se usa aquí, el término “muestra biológica” se refiere a un organismo entero o un subconjunto de sus tejidos, células o partes componentes (por ejemplo, líquidos corporales, incluyendo pero no limitados a sangre, moco, líquido linfático, líquido sinovial, líquido cefalorraquídeo, saliva, líquido amniótico, sangre de cordón amniótico, orina, líquido vaginal y semen). “Muestra biológica” se refiere además a un homogenado, lisado, extracto, cultivo celular o cultivo de tejido preparado de un organismo entero o un subconjunto de sus células, tejidos o partes componentes, o una fracción o parte de los mismos. Por último, “muestra biológica” se refiere a un medio, tal como un caldo nutriente o gel en el que se ha propagado un organismo, que contiene componentes celulares, tales como proteínas o polinucleótidos.

La invención presenta métodos de inhibir el crecimiento celular. El crecimiento celular se inhibe poniendo en contacto una célula con una composición de un ARN interferente pequeño (ARNip) de ZNFN3A1. ZNFN3A1 es una proteína con dedos de zinc que se sobreexpresa en tumores tales como carcinoma hepatocelular o adenocarcinoma colorrectal. El crecimiento de la célula que expresa ZNFN3A1 se puede inhibir por la presente invención. La célula se pone en contacto además con un agente potenciador de la transfección. La célula se suministra in vitro, in vivo o ex vivo. El sujeto es un mamífero, por ejemplo, un ser humano, un primate no humano, ratón, rata, perro, gato, caballo o vaca. La célula es una célula hepática o una célula de colon. De forma alternativa, la célula es una célula tumoral (es decir, célula cancerosa) tal como una célula de cáncer colorrectal o una célula de cáncer de hígado. Por ejemplo, la célula es una célula de adenocarcinoma colorrectal o una célula de carcinoma hepatocelular. Mediante inhibir el crecimiento celular se quiere decir que la célula tratada prolifera a una velocidad menor o tiene una viabilidad disminuida que una célula sin tratar. El crecimiento celular se mide mediante ensayos de proliferación conocidos en la técnica.

Mediante el término “ARNip” se quiere decir una molécula bicatenaria de ARN que previene la traducción de un ARNm diana. Se usan técnicas estándar de introducir ARNip en la célula, incluyendo esas en las que el ADN es un molde partir del que se transcribe ARN. El ARNip incluye una secuencia de ácido nucleico de ZNFN3A1 sentido, una secuencia de ácido nucleico de ZNFN3A1 antisentido o ambas. El ARNip se construye de modo que un único transcrito tiene las secuencias tanto sentido como antisentido complementaria del gen diana, por ejemplo, una horquilla.

El método se usa para alterar la expresión génica en una célula en la que la expresión de ZNFN3A1 está aumentada, por ejemplo, como resultado de transformación maligna de las células. La unión del ARNip a un transcrito de ZNFN3A1 en la célula diana produce una reducción en la producción de ZNFN3A1 por la célula. La longitud del oligonucleótido es al menos de 10 nucleótidos y puede ser tan larga como el transcrito ZNFN3A1 natural. Preferiblemente, el oligonucleótido tiene de 19-25 nucleótidos de longitud. Lo más preferiblemente, el oligonucleótido tiene menos de 75, 50 o 25 nucleótidos de longitud. Ejemplos de oligonucleótidos ARNip de ZNFN3A1 que inhiben la expresión de ZNFN3A1 en células de mamífero incluyen oligonucleótidos que contienen secuencias diana, por ejemplo, los nucleótidos 451-471, 532-552, 623-643, 625-645, 636-656, 726-746, 923-943, 1065-1085 y 1258-1278 de SEQ ID NO: 1.

Se conocen métodos para diseñar ARN bicatenarios que tengan la capacidad de inhibir la expresión génica en una célula diana. (Véase, por ejemplo, la patente de EE UU No. 6.506.559). Por ejemplo, un programa de ordenador para diseñar ARNip está disponible del sitio web a Ambion (http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html).

El programa de ordenador selecciona secuencias de nucleótidos para la síntesis de ARNip basado en el siguiente protocolo.

Selección de sitios diana de ARNip

1. Empezando con el codón de iniciación AUG del transcrito, rastrear en dirección 3' para secuencias de dinucleótidos AA. Registrar la aparición de cada AA y los 19 nucleótidos adyacentes en 3' como potenciales sitios diana del ARNip. Tuschl y col. recomiendan en contra de diseñar ARNip en las regiones 5' y 3' no traducidas (UTR) y regiones cerca del codón de iniciación (en 75 bases) ya que pueden ser más ricas en sitios de unión de proteínas reguladoras. Las proteínas de unión a las UTR y/o complejos de iniciación de la traducción pueden interferir con la unión del complejo ARNip endonucleasa.

2. Comparar los potenciales sitios diana con la base de datos genómica apropiada (humana, de ratón, rata, etc.) y eliminar de consideración cualquier secuencia diana con homología significativa a otras secuencias codificantes. Se sugiere usar BLAST, que se puede encontrar en el servidor del NCBI en: www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/

3. Seleccionar secuencias dianas cualificadas para síntesis. Es típico seleccionar varias secuencias diana en la longitud del gen para evaluar.

También se incluyen en la invención polinucleótidos aislados que incluyen las secuencias de ácido nucleico de secuencias diana, por ejemplo, los nucleótidos 451-471 (SEQ ID NO: 58), 532-552 (SEQ ID NO: 60), 623-643 (SEQ ID NO: 61), 625-645 (SEQ ID NO: 62), 636-656 (SEQ ID NO: 63), 726-746 (SEQ ID NO:... [Seguir leyendo]

1. Una composición que comprende un ARN interferente pequeño (ARNip) de ZNFN3A1 para su uso en tratar un tumor caracterizado por la sobreexpresión de ZNFN3A1 en un sujeto, en donde dicho ARNip comprende un ácido nucleico ZNFN3A1 sentido y un ácido nucleico ZNFN3A1 antisentido, y en donde dicho ARNip es específico para una diana de ZNFN3A1 seleccionada del grupo que consiste en los nucleótidos 451-471, 532552, 623-643, 625-645, 636-656, 726-746, 923-943, 1065-1085 y 1258-1278 de SEQ ID NO:1, en donde dicho ARNip de ZNFN3A1 tiene entre 19 y 25 nucleótidos de longitud.

2. Uso de una composición que comprende un ARN interferente pequeño (ARNip) de ZNFN3A1 para la preparación de una composición farmacéutica para tratar un tumor caracterizado por la sobreexpresión de ZNFN3A1 en un sujeto, en donde dicho ARNip comprende un ácido nucleico ZNFN3A1 sentido y un ácido nucleico ZNFN3A1 antisentido, y en donde dicho ARNip es específico para una diana de ZNFN3A1 seleccionada del grupo que consiste en los nucleótidos 451-471, 532-552, 623-643, 625-645, 636-656, 726746, 923-943, 1065-1085 y 1258-1278 de SEQ ID NO:1, en donde dicho ARNip de ZNFN3A1 tiene entre 19 y 25 nucleótidos de longitud.

3. La composición para uso de la reivindicación 1 o el uso de la reivindicación 2, en donde dicho ARNip tiene la fórmula general 5'-[A]-[B]-[A']-3', en donde [A] es una secuencia de ribonucleótidos que corresponde a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en los nucleótidos 451-471, 532-552, 623-643, 625-645, 636656, 726-746, 923-943, 1065-1085 y 1258-1278 de SEQ ID NO:1,

[B] es una secuencia de ribonucleótidos que consiste en de 3 a 23 nucleótidos, y [A'] es una secuencia de ribonucleótidos que consiste en la secuencia complementaria de [A].

4. La composición para uso de la reivindicación 3 o el uso de la reivindicación 3, en donde dicha composición comprende un agente potenciador de la transfección.

5. Un polinucleótido para el uso en el tratamiento de un tumor caracterizado por la sobreexpresión de ZNFN3A1, en donde el polinucleótido comprende una combinación de un ácido nucleico de cadena sentido y un ácido nucleico de cadena antisentido, en donde dicho ácido nucleico de cadena sentido comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en los nucleótidos 451-471, 532-552, 623-643, 625-645, 636-656, 726-746, 923-943, 1065-1085 y 1258-1278 de SEQ ID NO:1, y dicho ácido nucleico de cadena antisentido consiste en la secuencia complementaria de dicha secuencia de nucleótidos, en donde dicho polinucleótido es un oligonucleótido que tiene entre 19 y 25 nucleótidos de longitud.

6. El polinucleótido para uso de la reivindicación 5, en donde dichos ácido nucleico de cadena sentido y ácido nucleico de cadena antisentido están en la misma cadena.

7. Un vector para uso en el tratamiento de un tumor caracterizado por la sobreexpresión de ZNFN3A1, en donde el vector comprende un polinucleótido que comprende una combinación de secuencia de un ácido nucleico de cadena sentido y un ácido nucleico de cadena antisentido, en donde dicho ácido nucleico de cadena sentido comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en los nucleótidos 451-471, 532-552, 623-643, 625-645, 636-656, 726-746, 923-943, 1065-1085 y 1258-1278 de SEQ ID NO:1, y dicho ácido nucleico de cadena antisentido consiste en la secuencia complementaria de dicha secuencia de nucleótidos, en donde dicho polinucleótido es un oligonucleótido que tiene entre 19 y 25 nucleótidos de longitud.

8. El vector para uso de la reivindicación 7, en donde dicho polinucleótido tiene la fórmula general 5'-[A]-[B]-[A']3', en donde [A] es una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en los nucleótidos 451471, 532-552, 623-643, 625-645, 636-656, 726-746, 923-943, 1065-1085 y 1258-1278 de SEQ ID NO:1,

[B] es una secuencia de nucleótidos que consiste en de 3 a 23 nucleótidos, y [A'] es una secuencia de nucleótidos que consiste en la secuencia complementaria de [A].

9. Una composición para uso en el tratamiento de un tumor caracterizado por la sobreexpresión de ZNFN3A1, en donde la composición comprende al menos un ARNip que comprende una combinación de un ácido nucleico de cadena sentido y un ácido nucleico de cadena antisentido, en donde dicho ácido nucleico de cadena sentido comprende una secuencia de ribonucleótidos que corresponde a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en los nucleótidos 451-471, 532-552, 623-643, 625-645, 636-656, 726-746, 923-943, 1065-1085 y 1258-1278 de SEQ ID NO:1, y dicho ácido nucleico de cadena antisentido consiste en la secuencia complementaria de dicha secuencia de nucleótidos, en donde dicho ARNip tiene entre 19 y 25 nucleótidos de longitud.

10. Una molécula bicatenaria para su uso en el tratamiento de un tumor caracterizado por la sobreexpresión de ZNFN3A1, en donde la molécula bicatenaria comprende una cadena sentido y una cadena antisentido, en donde la cadena sentido comprende una secuencia de ribonucleótidos que corresponde a una secuencia diana de ZNFN3A1, y en donde la cadena antisentido comprende una secuencia de ribonucleótidos que es

complementaria a dicha cadena sentido, en donde dicha cadena sentido y dicha cadena antisentido hibridan entre sí para formar dicha molécula bicatenaria, en donde dicha molécula bicatenaria, cuando se introduce en una célula que expresa el gen ZNFN3A1, inhibe la expresión de dicho gen, y en donde dicha secuencia diana de ZNFN3A1 se selecciona del grupo que consiste en los nucleótidos 451-471, 532-552, 623-643, 625-645, 636-656, 726-746, 923-943, 1065-1085 y 1258-1278 de SEQ ID NO:1, y dicha molécula bicatenaria es un oligonucleótido de entre 19 y 25 nucleótidos de longitud.

11. La molécula bicatenaria para uso de la reivindicación 10, en donde un único transcrito de ribonucleótidos comprende la cadena sentido y la cadena antisentido, dicha molécula bicatenaria comprende además una secuencia monocatenaria de ribonucleótidos que une dicha cadena sentido y dicha cadena antisentido.

12. Un vector que codifica la molécula bicatenaria de la reivindicación 10 o 11, para uso de la reivindicación 10.

13. El vector para uso de la reivindicación 12, en donde el vector codifica un transcrito que tiene una estructura secundaria, en donde el transcrito comprende la cadena sentido y la cadena antisentido.

14. El vector para uso de la reivindicación 13, en donde el transcrito comprende además una secuencia monocatenaria de ribonucleótidos que une dicha cadena sentido y dicha cadena antisentido.

15. La composición para uso de la reivindicación 1 o 11, el uso de la reivindicación 2, el polinucleótido para uso de la reivindicación 5, el vector para uso de la reivindicación 7 o la molécula bicatenaria para uso de la reivindicación 10, en donde dicho tumor es un cáncer colorrectal o cáncer de hígado.

16. La composición para uso, el uso, el polinucleótido para uso, el vector para uso o la molécula bicatenaria para uso de la reivindicación 15, en donde

(a) el cáncer colorrectal es un adenocarcinoma; o

(b) el cáncer de hígado es un carcinoma hepatocelular.