Un método para la producción de un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a la hormona paratiroidea biológicamente activa,

denominada PTH (1-84) en la porción N-terminal de PTH (1-84), en la cual dicha porción Nterminal consiste de (i) los tres residuos de aminoácidos del N-terminal de PTH (1-84), o (ii) los cuatro residuos de aminoácidos del N-terminal de PTH (1-84); el método que comprende los pasos de: a) administrar un primer antígeno peptídico a un animal huésped para inducir la producción de anticuerpos contra dicho primer antígeno peptídico en dicho animal huésped, dicho primer antígeno peptídico que se selecciona del grupo que consiste de las ID SEC NO. 3, ID SEC NO. 4, ID SEC NO. 5, ID SEC NO. 6, PTH (1-34) y PTH (1-84), donde dicho animal huésped no es un humano; b) monitorear el anticuerpo producido por dicha administración de dicho primer antígeno a dicho animal huésped; c) extraer los antisueros producidos en dicho animal huésped por dicha administración de dicho primer antígeno peptídico; d) aislar y seleccionar al menos un anticuerpo a partir de dichos antisueros extraídos en el paso c) por cromatografía de afinidad utilizando un segundo antígeno peptídico que se selecciona del grupo que consiste de las ID SEC NO. 3, ID SEC NO. 4, ID SEC NO. 5 e ID SEC NO.6; e) eliminar dicho al menos un anticuerpo aislado en el paso d) que tiene especificidad para un antígeno peptídico seleccionado del grupo que consiste de PTH (4-34), PTH (5-34), PTH (4-84) y PTH (5-84) mediante cromatografía de afinidad utilizando un tercer antígeno peptídico seleccionado del grupo que consiste de PTH (4-34), PTH (5-34), PTH (4-84) y PTH(5-84); y f) eliminar dicho anticuerpo en los pasos d) y e) que tiene afinidad de unión por al menos los primeros tres o cuatro residuos de aminoácidos de la porción N-terminal de la PTH y en el cual el anticuerpo aislado no tiene afinidad de unión por cualquiera de los residuos de aminoácidos en o más allá del quinto residuo de aminoácido del N-terminal de la PTH mediante la recolección del eluato producido a partir del paso e).

Antecedentes de la invención

La hormona paratiroidea (PTH) y su importancia en la regulación de la concentración de iones de calcio en la sangre es bien conocida. En este sentido, esta hormona se crea por las glándulas paratiroideas y, en combinación con otros factores, actúa en la regulación de los niveles de iones de calcio en la sangre, de manera tal que la misma se mantiene en una concentración constante, tanto en las células como en los fluidos que las rodean. Esencialmente, la PTH actúa en la liberación del calcio almacenado en el cuerpo cuando los niveles del calcio sérico disminuyen. Por otra parte, esta secreción se suprime en la medida en que la concentración del calcio sérico se incrementa.

En su forma completa, la PTH comprende un péptido único compuesto de 84 aminoácidos. La secuencia específica de la PTH, al igual que se proporciona para una pluralidad de especies, a saber humanos, ratas, ratones, bóvidos, perros, cerdos, gatos y monos, se representa en la Figura 1, y una variante de la misma en la Figura 2, la cual ilustra la estructura relativamente consistente que mantiene esta hormona entre dichas especies identificadas.

Debido a su importancia en el metabolismo del calcio, no solamente para los humanos sino para una variedad de especies, la medición precisa de la PTH ha sido y continúa siendo de importancia clínica sustancial. Como está bien documentado, los niveles séricos de la PTH sirven como un parámetro importante para los pacientes que tienen enfermedades tales como la hipercalcemia, el hiperparatiroidismo primario y la osteoporosis, entre muchas otras. La PTH también se vuelve de importancia clínica sustancial en pacientes que sufren de insuficiencia renal crónica quienes, debido a las anomalías de la PTH, pueden desarrollar osteodistrofia renal.

A pesar de su importante papel en el metabolismo y su significación clínica, continúan existiendo dificultades sustanciales en cuanto a la determinación de los niveles de PTH biológicamente activa circulante. En primer lugar, es bien conocido que la PTH está normalmente presente en niveles extremadamente bajos, los cuales están normalmente entre 10 pg/ml y 65 pg/ml. Además, se conoce que el péptido de la PTH puede estar presente en una variedad de fragmentos de PTH circulantes, y en particular, en fragmentos grandes circulantes de PTH no-(1-84), los cuales parecen co-emigrar cromatográficamente con la molécula de PTH (7-84), y se sabe que interfieren significativamente con los ensayos de mediciones convencionales de PTH. De hecho, los fragmentos grandes de PTH no-(1-84) pueden representar aproximadamente la mitad (1/2) de la PTH que se mide por la mayoría de los ensayos actuales. Ejemplos de las actuales deficiencias de la medición exacta de PTH se establecen en la solicitud internacional del Tratado de Cooperación en materia de Patentes No. PCT/US00/00855, publicación internacional No. WO/00/42437, titulada Methods for Differentiating and Monitoring Parathyroid and Bone Related Diseases, y en Lepage, Raymond y col., A Non-(1-84) Circulating Parathyroid Hormone (PTH) Fragment Interferes With Intact PTH Commercial Assay Measurement in Uremic Samples, Clinical Chemistry 44 4, 1998, páginas 805-809.

En un intento de abordar estas deficiencias, se introdujo, por Scantibodies Laboratory, de Santee, California, un nuevo ensayo para detectar los niveles de PTH el cual incorpora un anticuerpo trazador que tiene una especificidad de unión con el final de la fracción N-terminal de la PTH humana, y, más específicamente, con los primeros seis residuos de aminoácidos de la misma. Como se entiende actualmente, este ensayo parece minimizar la reactividad cruzada con los fragmentos grandes de PTH no-(1-84). Sin embargo, para derivar estos anticuerpos se requiere esfuerzo y gasto considerables en la purificación de los mismos. Además, estos anticuerpos trazadores tienen el máximo reconocimiento solamente para el primer residuo de aminoácido de la PTH, y una especificidad sustancialmente reducida para cualquiera los residuos subsiguientes, haciendo imposible por consiguiente su uso para otras especies donde el primer aminoácido es diferente. Estas desventajas se discuten en el artículo de John,

M. R. y col., titulado A Novel Immunoradiometric Assay Detects Full-Length Human PTH but not Amino-Terminally Truncated Fragments: Implications for PTH Measurements in Renal Failure, The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, Vol. 84, No. 11, 1999, p. 4287-4290.

Los documentos US2002/0110871 A1, DE 4434551 A1 y WO03/003986 A2, se refieren en general a anticuerpos contra la hormona paratiroidea y a los métodos relacionados.

Por lo tanto, ha sido y continúa siendo una necesidad largamente sentida en el estado de la técnica, un ensayo de parejas de unión y el método de generación de las mismas, que sea específico para la PTH intacta bioactiva, que pueda determinar los niveles de PTH con reactividad cruzada mitigada para los fragmentos peptídicos de la PTH. Igualmente, existe una necesidad en el estado de la técnica de mejorar las parejas de unión a la PTH que puedan medir los niveles de PTH en una manera más coste-efectiva, que tengan una mayor afinidad por la PTH y que puedan ser fácilmente incorporadas en juegos de reactivos de inmunoensayo y similares. Más aún, existe una necesidad de parejas de unión, es decir, de anticuerpos que tengan un reconocimiento de unión que sea específico para PTH y que puedan utilizarse para detectar los niveles de PTH en una amplia variedad de especies. Finalmente, existe una necesidad en el estado de la técnica de una pareja de unión mejorada que tenga una alta afinidad de unión por la PTH que pueda ser fácilmente obtenida usando los mecanismos convencionales que requieran purificación mínima, que resulte en un mayor reconocimiento de unión para la PTH intacta, que posea una reactividad cruzada mínima para los fragmentos grandes de PTH no-(1-84), y que se pueda derivar utilizando métodos que generan rendimientos de anticuerpos mayores que las parejas unión del estado de la técnica anterior.

Breve sumario de la invención

La presente invención específicamente se destina y alivia las deficiencias anteriormente identificadas en el estado de la técnica. En este sentido, la presente invención se dirige a un método para producir anticuerpos que son útiles en determinar los niveles de PTH intacta bioactiva en una muestra de fluido, tal como suero, plasma o medios de cultivo celular de acuerdo con el objeto de la reivindicación 1. Los métodos de la presente invención tienen las ventajas particulares de poseer mayor afinidad por la PTH, y en particular, están diseñados para tener un reconocimiento novedoso para los primeros pocos residuos de aminoácidos, que se extienden desde el primer residuo del N-terminal de la PTH, pero preferentemente que no vaya más allá del cuarto residuo de aminoácido de la PTH. Los anticuerpos tendrán una especificidad para los tres primeros residuos de aminoácidos del N-terminal de la PTH. Los anticuerpos además no tienen reactividad cruzada con las formas moleculares grandes de PTH no-(1-84). Por otra parte, los métodos de producción de los anticuerpos de acuerdo con la presente invención tienen reactividad cruzada sustancial con una gran variedad de especies, y pueden utilizarse para detectar los niveles de PTH no solamente en humanos, sino también en ratas, ratones, bóvidos, perros, cerdos, gatos y monos.

El antígeno comprende la fórmula

VAL-SER-GLU-ILE-GLN-X-MET-HIS-ASN-LEU-GLY

en la cual X se selecciona del grupo que consiste de LEU [ID. SEC.1] y PHE [ID SEC NO. 2]. En ese contexto, este péptido antigénico representa los residuos de aminoácidos 2-12 de la PTH, con el sexto residuo de aminoácido de la misma que es selectivo entre LEU y PHE, el primero que existe en la PTH de los humanos, ratas, ratones y cerdos, por una parte, y el segundo que es inherente a la PTH de los bovinos y perros, por otra parte. En una realización más altamente preferida, el antígeno comprende un péptido que tiene la fórmula

Y-VAL-SER-GLU-ILE-GLN-X-MET-HIS-ASN-LEU-GLY

en la cual X es un residuo de aminoácido seleccionado entre LEU y PHE, según lo mencionado previamente, e Y es un residuo de aminoácido que consistente en, ya sea SER o ALA [ID SEC NO. 3, ID SEC NO. 4, ID SEC NO. 5 e ID SEC NO. 6, respectivamente], el primero que refleja el aminoácido presente en humanos, perros y cerdos, y el segundo que es inherente a la PTH de ratas, ratones y bovinos.

El antígeno comprende la fórmula

VAL-SER-GLU-ILE-GLN-X-MET-HIS-ASN-LEU-GLY-LYS-HIS-LEU... [Seguir leyendo]

1. Un método para la producción de un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a la hormona paratiroidea biológicamente activa, denominada PTH (1-84) en la porción N-terminal de PTH (1-84), en la cual dicha porción N-terminal consiste de (i) los tres residuos de aminoácidos del N-terminal de PTH (1-84), o (ii) los cuatro residuos de aminoácidos del N-terminal de PTH (1-84); el método que comprende los pasos de:

a) administrar un primer antígeno peptídico a un animal huésped para inducir la producción de anticuerpos contra dicho primer antígeno peptídico en dicho animal huésped, dicho primer antígeno peptídico que se selecciona del grupo que consiste de las ID SEC NO. 3, ID SEC NO. 4, ID SEC NO. 5, ID SEC NO. 6, PTH (1-34) y PTH (1-84), donde dicho animal huésped no es un humano; b) monitorear el anticuerpo producido por dicha administración de dicho primer antígeno a dicho animal huésped; c) extraer los antisueros producidos en dicho animal huésped por dicha administración de dicho primer antígeno peptídico; d) aislar y seleccionar al menos un anticuerpo a partir de dichos antisueros extraídos en el paso c) por cromatografía de afinidad utilizando un segundo antígeno peptídico que se selecciona del grupo que consiste de las ID SEC NO. 3, ID SEC NO. 4, ID SEC NO. 5 e ID SEC NO.6; e) eliminar dicho al menos un anticuerpo aislado en el paso d) que tiene especificidad para un antígeno peptídico seleccionado del grupo que consiste de PTH (4-34), PTH (5-34), PTH (4-84) y PTH (5-84) mediante cromatografía de afinidad utilizando un tercer antígeno peptídico seleccionado del grupo que consiste de PTH (4-34), PTH (5-34), PTH (4-84) y PTH(5-84); y f) eliminar dicho anticuerpo en los pasos d) y e) que tiene afinidad de unión por al menos los primeros tres o cuatro residuos de aminoácidos de la porción N-terminal de la PTH y en el cual el anticuerpo aislado no tiene afinidad de unión por cualquiera de los residuos de aminoácidos en o más allá del quinto residuo de aminoácido del N-terminal de la PTH mediante la recolección del eluato producido a partir del paso e).

2. El método de la reivindicación 1, en el que en el paso a), dicho animal huésped se selecciona del grupo que consiste de un ratón y un conejo.

3. El método de la reivindicación 1, en el que en el paso a), dicho animal huésped comprende al menos una cabra.

4. El método de la reivindicación 1, en el que en el paso a), dicha PTH (1-34) proviene de una especie seleccionada del grupo que consiste de un humano, una rata, un ratón, un bovino, un perro, un cerdo, un gato, y un mono.

5. El método de la reivindicación 1, en el que en el paso a), dicho primer antígeno peptídico tiene una proteína portadora acoplada al mismo.

6. El método de la reivindicación 1, en el que en el paso a), dicha PTH (1-84) proviene de una especie seleccionada del grupo que consiste de un humano, una rata, un ratón, un bovino, un perro, un cerdo, un gato, y un mono.