Inmunoensayos para everolimús.

Un procedimiento de determinación de la concentración de everolimús en una muestra,

comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

a) proporcionar un competidor marcado que comprende everolimús acoplado con un marcador detectable a través de un ligamiento oxima y que tiene la fórmula: **Fórmula**

en la que

X1 es una cadena ligadora que comprende uno o más átomos, cada uno de los cuales puede estar no sustituido o sustituido y puede ser ramificado o no ramificado;

Y se selecciona del grupo consistente en -C(O)-, -NH-, -S-, -CH2- y -O-; y

Z es dicho marcador detectable;

b) proporcionar un anticuerpo anti-everolimús producido usando un compuesto antigénico que comprende everolimús acoplado con un portador antigénico a través de un ligador y que tiene la fórmula: **Fórmula**

en la que

n es 0 o 1;

X es una cadena ligadora que comprende 3-10 átomos de carbono o heteroátomos, en la que dicha cadena ligadora puede estar sustituida o no sustituida y puede ser lineal o ramificada;

Y se selecciona del grupo consistente en -C(O)-, -NH-, -S-, -CH2- y -O-; y

Z es dicho portador antigénico;

c) combinar dicha muestra, dicho anticuerpo anti-everolimús y dicho competidor marcado, compitiendo el everolimús en dicha muestra con dicho competidor marcado por la unión a dicho anticuerpo anti-everolimús; y

d) determinar la concentración de everolimús en dicha muestra midiendo la cantidad de dicho competidor marcado no unido a dicho anticuerpo mediante la detección de dicho marcador.

Inmunoensayos para everolimus

CAMPO DE LA INVENCION

La invencion se refiere en general a reactivos y a procedimientos para la determinacion de everolimus en fluidos biologicos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

El everolimus [40-O- (2-hidroxietil) rapamicina] es un inmunosupresor macrolido novedoso. El everolimus (tambien conocido como SDZ-RAD, RAD o Certican®) se ha desarrollado por Novartis (Nashan B. "The role of Certican in the many pathways of chronic rejection". Transplantation Proceedings, 2001, 33: 3215-3230) en un esfuerzo por mejorar la rapamicina (sirolimus) , un inhibidor de la senal de proliferacion que bloquea las senales de transduccion activadas por factor de crecimiento en las respuestas celulares ante aloantigeno (Cottens S, et al. "O-Alkylated rapamycin derivatives and their use, particularly as immunosupressants", documento WO-009409010 28 de abril de 1994) . El everolimus tiene una mayor estabilidad y una solubilidad potenciada en disolventes organicos, asi como una farmacocinetica mas favorable con menos efectos secundarios que la rapamicina (sirolimus) . El everolimus se ha usado junto con una microemulsion de ciclosporina (Neoral®, Novartis) para aumentar la eficacia del regimen inmunosupresor (Kovarik JM, et al. "Exposure-response relationship for Certican in de novo kidney transplantation: define a therapeutic range". Transplantation 2002; 73 (6) : 920-925) .

La complejidad del estado clinico y las diferencias individuales en sensibilidad a los efectos inmunosupresores y nefrotoxicos han sido bastante problematicos para que los medicos equilibraran entre eficacia terapeutica y aparicion de efectos secundarios (Wallemacq, Pierre E. "Therapeutic monitoring of immunosuppressant drugs. Where are we?" Clinical Chemistr y and Laborator y Medicine (2004) , 42 (11) , 1204-1211) . La monitorizacion terapeutica de farmacos (MTF) , definida como la medida e interpretacion de la concentracion de estos farmacos en fluidos biologicos, con el objetivo final de la prediccion de respuestas organicas, se ha convertido en una parte integral de los protocolos de transplante.

Se ha resenado la concentracion terapeutica de everolimus (Kovarik et al.) como de 3-15 ng/ml, que era coherente con eficacia con minimizacion de efectos adversos en transplante de rinon. Los datos recientes han mostrado tambien que la monitorizacion terapeutica de farmacos (MTF) de everolimus beneficiaria a pacientes de transplante de corazon (Starling, Randall C; et al. "Therapeutic drug monitoring for everolimus in heart transplant recipients based on exposure-effect modeling". American Journal of Transplantation (2004) , 4 (12) , 2126-2131) . Las concentraciones minimas de everolimus eran estables en el primer ano despues del transplante y promediaban 5, 2 ± 3, 8 y 9, 4 ± 6, 3 ng/ml en pacientes tratados con 1, 5 y 3 mg/dia, respectivamente.

Se ha resenado la MTF de everolimus (McMahon LM, et al. "High-throughput analysis of everolimus (RAD001) and cyclosporin A (CsA) in whole blood by liquid chromatography/ mass spectrometr y using a semi-automated 96-well solid-phase extraction system". Rapid Comm. Mass Spectrometr y 2000; 14: 1965-1971; Brignol N, et al. "Highthroughput semi-automated 96-well liquid/liquid extraction and liquid chromatography/mass spectrometric analysis of Certican (RAD001) and cyclosporin A (CsA) in whole blood". Rapid Communications in Mass Spectrometr y 2001; 15: 898-907; Streit F. et al. "Rapid liquid chromatography-tandem mass spectrometr y routine method for simultaneous determination of sirolimus, everolimus, tacrolimus, and cyclosporin A in whole blood". Clinical Chemistr y . 2002; 48 (6) : 955-958) . Sin embargo, los procedimientos que usan HPLC y CL/EM pueden ser impracticables para uso comercial debido, por ejemplo, al largo tiempo de preparacion de la muestra, al largo tiempo de ensayo, al alto coste y a procedimientos trabajosos. Para MTF rutinaria de everolimus, es deseable la disponibilidad de pruebas automatizadas sencillas y analizadores clinicos de alto rendimiento.

El documento US6328970 (B1) da a conocer conjugados de rapamicina que pueden usarse como moleculas inmunogenicas para la generacion de anticuerpos especificos de rapamicina o un derivado de la misma, para medir los niveles de rapamicina o derivados de la misma, para aislar proteinas de union a rapamicina y para detectar anticuerpos especificos de rapamicina o derivados de la misma. El documento US6328970 da a conocer tambien anticuerpos monoclonales especificos de rapamicina o un derivado de anillo abierto de rapamicina.

El documento US2002022717 (A1) da a conocer anticuerpos monoclonales de rapamicina y se dan a conocer derivados 40-O-alquilados de rapamicina, junto con haptenos novedosos, conjugados inmunogenicos y procesos para prepararlos y kits de ensayo para usarlos.

SUMARIO DE LA INVENCION

La presente invencion esta dirigida a derivados novedosos de everolimus y a inmunogenos novedosos de everolimus. La presente invencion esta tambien dirigida a anticuerpos policlonales y monoclonales generados usando inmunogenos de everolimus, asi como a competidores y trazadores marcados. Estos anticuerpos, conjugados y trazadores son utiles en inmunoensayos para la deteccion de everolimus en fluidos biologicos.

En un aspecto de la invencion, que se describe pero no se reivindica, se proporcionan inmunoensayos competitivos para determinar la presencia de everolimus en una muestra. Los inmunoensayos competitivos ilustrativos comprenden un anticuerpo capaz de unirse especificamente a everolimus, y un compuesto de everolimus conjugado con un marcador detectable, en los que el compuesto de everolimus conjugado se configura para competir con el 5 everolimus en la muestra para union al anticuerpo, y en los que el marcador proporciona una senal indicativa de la concentracion de everolimus en la muestra cuando el everolimus en la muestra esta presente a concentraciones de monitorizacion terapeutica de farmacos. En una realizacion, el inmunoensayo es adecuado para monitorizar everolimus en el intervalo de aproximadamente 3 a aproximadamente 15 ng/ml. En otra realizacion, el inmunoensayo competitivo proporciona una senal indicativa de la concentracion de everolimus en un intervalo mas amplio, ilustrativamente de aproximadamente 0 a aproximadamente 40 ng/ml.

En otro aspecto de la invencion, se proporcionan procedimientos para determinar la concentracion de everolimus en una muestra. Los procedimientos son como se definen en la reivindicacion 1.

En aun otro aspecto de la invencion, que se describe pero no se reivindica, se proporcionan compuestos que tienen la siguiente estructura Formula II en la que n es 0 o 1; X es una cadena ligadora que comprende 3-10 atomos de carbono o heteroatomos, en la que la cadena ligadora puede estar sustituida o no sustituida y puede ser lineal o ramificada;

Y se selecciona del grupo consistente en -C (O) -, -NH-, -S-, -CH2- y -O-; y

Z es un portador antigenico o un marcador.

En una realizacion ilustrativa particular, X es -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-, Y es -C (O) - y Z es el portador antigenico.

Los anticuerpos producidos usando dichos compuestos se describen tambien pero no se reivindican. Se proporcionan tambien kits de inmunoensayo que usan los anticuerpos, estos kits para determinar la concentracion de everolimus en una muestra son como se definen en la reivindicacion 5. Resultaran evidentes rasgos adicionales de la presente invencion para los expertos en la materia tras la consideracion de la siguiente descripcion detallada de las realizaciones preferidas, que ejemplifican el mejor modo de llevar a cabo la invencion como se entiende actualmente.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

La Fig. 1 muestra la estructura de un derivado de everolimus ilustrativo de la presente invencion, La Fig. 2 muestra la sintesis de formiato de RAD anclado, La Fig. 3 muestra la sintesis de RAD-acido (desproteccion) ,

La Fig. 4 muestra la sintesis de RAD-822 (activacion de NHS) , La Fig. 5 muestra la sintesis de RAD 822: trazador FAMCO-E FP, La Fig. 6 muestra la sintesis de RAD 822: inmunogeno de BSA, La Fig. 7 muestra la estructura de un derivado 32-oxima de everolimus, La Fig. 8 muestra un ester activado del derivado 32-oxima de la Fig. 8,

La Fig. 9 muestra una curva de calibracion de (FPIA) : eje X-valores del patron, eje Y- indice (mP) de anticuerpos (policlonales) , trazador FP (RAD822:FAMCO-E) , La Fig. 10 muestra la comparacion de un ensayo de FPIA de everolimus segun la presente invencion frente a CL/EM en pacientes de transplante de rinon,

La Fig. 11 muestra la comparacion de un ensayo de FPIA de everolimus segun la presente invencion frente a CL/EM

en pacientes de transplante de corazon, y La Fig. 12 es una curva de calibracion... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de determinacion de la concentracion de everolimus en una muestra, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

a) proporcionar un competidor marcado que comprende everolimus acoplado con un marcador detectable a traves de un ligamiento oxima y que tiene la formula:

en la que X1 es una cadena ligadora que comprende uno o mas atomos, cada uno de los cuales puede estar no sustituido o sustituido y puede ser ramificado o no ramificado; 10 Y se selecciona del grupo consistente en -C (O) -, -NH-, -S-, -CH2- y -O-; y Z es dicho marcador detectable; b) proporcionar un anticuerpo anti-everolimus producido usando un compuesto antigenico que comprende everolimus acoplado con un portador antigenico a traves de un ligador y que tiene la formula:

en la que n es 0 o 1;

X es una cadena ligadora que comprende 3-10 atomos de carbono o heteroatomos, en la que dicha cadena ligadora 5 puede estar sustituida o no sustituida y puede ser lineal o ramificada;

Y se selecciona del grupo consistente en -C (O) -, -NH-, -S-, -CH2- y -O-; y

Z es dicho portador antigenico;

c) combinar dicha muestra, dicho anticuerpo anti-everolimus y dicho competidor marcado, compitiendo el everolimus en dicha muestra con dicho competidor marcado por la union a dicho anticuerpo anti10 everolimus; y

d) determinar la concentracion de everolimus en dicha muestra midiendo la cantidad de dicho competidor marcado no unido a dicho anticuerpo mediante la deteccion de dicho marcador.

2. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que X es -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2- e Y es -C (O) -.

3. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que dicho anticuerpo anti-everolimus tiene mayor afinidad por 15 dicho everolimus en dicha muestra que por dicho competidor marcado.

4. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la etapa (d) de determinacion de la cantidad de dicho competidor marcado no unido a dicho anticuerpo anti-everolimus se efectua mediante un ensayo automatizado seleccionado del grupo consistente en: FPAI, inmunoensayo de microparticulas homogeneas (inmunoturbidimetrico) , inmunoensayo de donante de enzima clonada (CEDIA) , inmunoensayo heterogeneo quimioluminiscente e inmunoensayo de flujo lateral.

5. Un kit para determinar la concentracion de everolimus en una muestra, comprendiendo dicho kit: un competidor marcado que comprende everolimus acoplado con un marcador detectable a traves de un ligamiento oxima y que tiene la formula:

en la que X1 es una cadena ligadora que comprende uno o mas atomos, cada uno de los cuales puede estar no sustituido o sustituido y puede ser ramificado o no ramificado;

Y se selecciona del grupo consistente en -C (O) -, -NH-, -S-, -CH2- y -O-; y

Z es dicho marcador detectable; y

un anticuerpo anti-everolimus;

en el que dicho anticuerpo anti-everolimus se produce usando un compuesto antigenico que comprende everolimus acoplado con un portador antigenico a traves de un ligador y que tiene la formula:

en la que n es 0 o 1;

X es una cadena ligadora que comprende 3-10 atomos de carbono o heteroatomos, en la que dicha cadena ligadora puede estar sustituida o no sustituida y puede ser lineal o ramificada; Y se selecciona del grupo consistente en -C (O) -, -NH-, -S-, -CH2- y -O-; y

Z es dicho portador antigenico; y en el que dicho competidor marcado compite con dicho everolimus en dicha muestra por la union a dicho anticuerpo anti-everolimus.

6. El kit de la reivindicacion 5, en el que X es -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2- e Y es -C (O) -.

7. El kit de la reivindicacion 5, en el que dicho anticuerpo anti-everolimus tiene mayor afinidad por dicho 10 everolimus en dicha muestra que por dicho competidor marcado.

8. El kit de la reivindicacion 5, en el que dicho anticuerpo anti-everolimus es un anticuerpo monoclonal.

9. El kit de la reivindicacion 5, en el que dicho anticuerpo anti-everolimus es un anticuerpo policlonal.

Fii ra 1 Fii ra 2 Fii ra 3 Fii ra 4 Fii ra 5 Fii ra 6 Fii ra º

Fii ra º Fii ra º

Fii ra 1º Fii ra 11

Fii ra 12