ANTICUERPO MONOCLONAL ANTI ANTITROMBINA CITRULINADA HUMANA Y SUS USOS.
Anticuerpo monoclonal anti antitrombina citrulinada humana y sus usos.
Comprende un anticuerpo monoclonal que fija específicamente la antitrombina citrulinada humana, la línea de hibridoma productora de dicho anticuerpo monoclonal y el uso del anticuerpo para la detección cualitativa o cuantitativa la antitrombina citrulinada humana en una muestra biológica aislada del cuerpo. Se encuentra aplicación en el diagnóstico y pronóstico de distintas enfermedades en el que esta modificación post-traduccional forma parte del mecanismo patológico
Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200802436.
Solicitante: UNIVERSIDAD DE MURCIA.
Nacionalidad solicitante: España.
Provincia: MURCIA.
Inventor/es: VICENTE GARCIA,VICENTE, YELAMOS LOPEZ,JOSE, BERENGUER PINA,JOSE JAVIER, CORRAL DE LA CALLE,JAVIER, ORDOÑEZ GONZALEZ,ADRIANA.
Fecha de Solicitud: 14 de Agosto de 2008.
Fecha de Publicación: .
Fecha de Concesión: 21 de Julio de 2011.
Clasificación Internacional de Patentes:
- A61K38/57 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE. › A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › A61K 38/00 Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00). › que provienen de animales; que provienen de humanos.
- A61K39/395C4
- G01N33/53 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Ensayos inmunológicos; Ensayos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas; Materiales a este efecto.
- G01N33/564 G01N 33/00 […] › para complejos inmunológicos preexistentes o enfermedades autoinmunes.
Clasificación PCT:
- A61K38/57 A61K 38/00 […] › que provienen de animales; que provienen de humanos.
- A61K39/395 A61K […] › A61K 39/00 Preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos (materiales para ensayos inmunológicos G01N 33/53). › Anticuerpos (aglutininas A61K 38/36 ); Inmunoglobulinas; Inmunosuero, p. ej. suero antilinfocitario.
- A61P19/02 A61 […] › A61P ACTIVIDAD TERAPEUTICA ESPECIFICA DE COMPUESTOS QUIMICOS O DE PREPARACIONES MEDICINALES. › A61P 19/00 Medicamentos para el tratamiento de problemas del esqueleto. › para problemas de las articulaciones, p.ej. artritis, artrosis.
- A61P29/00 A61P […] › Agentes analgésicos, antipiréticos o antiinflamatorios que no actúan sobre el sistema nervioso central, p. ej. agentes antirreumáticos; Antiinflamatorios no esteroideos (AINEs).
- G01N33/53 G01N 33/00 […] › Ensayos inmunológicos; Ensayos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas; Materiales a este efecto.
- G01N33/564 G01N 33/00 […] › para complejos inmunológicos preexistentes o enfermedades autoinmunes.
PDF original: ES-2346618_A1.pdf
Fragmento de la descripción:
Anticuerpo monoclonal anti antitrombina citrulinada humana y sus usos.
La presente invención se encuadra principalmente en el área de la Inmunología, y el sector de aplicación sería el sanitario con fines diagnósticos y pronósticos en hemostasia y trombosis, reumatología, neurología y enfermedades inflamatorias.
Estado de la técnica anterior
La antitrombina es el anticoagulante endógeno más relevante en la hemostasia, de forma que su deficiencia completa es letal, y la deficiencia parcial incrementa de forma muy significativa el riesgo trombótico (Ishiguro y col. J Clin Invest. 2000; 106: 873-8).
Como el resto de las proteínas de la superfamilia de las serpinas a la que pertenece, la antitrombina se caracteriza por una gran flexibilidad estructural, crucial para su correcta funcionalidad, pero que la hace extremadamente sensible a diferentes factores tanto genéticos como ambientales (Hernández-Espinosa y col. Thromb Haemost. 2007; 98: 557-63).
Un de los factores que provocan la pérdida completa de la funcionalidad anticoagulante de la antitrombina es la citrulinación (Chang y col. Rheumatology. 2005; 44: 293-8; Píke y col. J Biol Chem. 1997; 272: 19652-5). Este proceso puede producirse en situaciones fisiopatológicas cuando las enzimas PAD, responsables de esta modificación post-traduccional, se liberan al plasma (György y col. Int J Biochem Cell Biol. 2006; 38: 1662-77). La cuantificación de la cantidad de antitrombina citrulinada en muestras biológicas humanas puede servir de marcador de riesgo trombótico y definir estrategias terapéuticas eficaces, especialmente en pacientes con elevada tasa de citrulinación descrita (Marini y col. Archivos de Alergia e Inmunología Clínica (AAIC). 2004; 35: 39-45). Además, la detección y cuantificación de antitrombina citrulinada podría tener implicaciones adicionales tanto diagnósticas como pronosticas en enfermedades en las que la citrulinación forma parte del mecanismo patológico (artritis reumatoide, esclerosis múltiple, alzheimer, psoriasis, etc) (György y col. Int J Biochem Cell Biol. 2006; 38: 1662-77).
El desarrollo de anticuerpos monoclonales dirigidos específicamente contra modificaciones post-traduccionales de una proteína es complejo y no siempre se logra diferenciar la forma modificada.
En general, la citrulinación, como modificación post-traduccional, ha sido muy poco estudiada pese a jugar un papel relevante en diferentes patologías (artritis reumatoide, esclerosis múltiple, alzheimer, psoriasis). Hasta la fecha, su estudio en hemostasia ha sido anecdótico, a pesar de la relevancia funcional que causa en el principal anticoagulante, la antitrombina.
Hasta la fecha, en el contexto de esta modificación post-traduccional, se han desarrollado:
Pese a la existencia de anticuerpos policlonales dirigidos contra la antitrombina (Dako, A0296), anticuerpos generados frente a posibles modificaciones post-traduccionales de esta molécula son nulos.
Existe por tanto una necesidad de disponer de anticuerpos monoclonales específicos frente a antitrombina citrulinada humana.
Explicación de la invención
Son objeto de la presente invención un anticuerpo monoclonal anti antitrombina citrulinada humana, así como la línea de hibridoma empleada en su preparación, y el uso de dicho anticuerpo.
La presente invención describe la generación, en ratones Balb/c, de un anticuerpo monoclonal capaz de reconocer específicamente moléculas de antitrombina humana portadoras de una modificación post-traduccional, la citrulinación.
Un segundo aspecto de la invención se refiere a la línea de hibridoma que producen los anticuerpos monoclonales anti antitrombina citrulinada humana. Dicha línea de hibridoma ha sido depositada el día 06 de Junio de 2008 en la European Collection of Cell Cultures (ECACC) de acuerdo con las condiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para Procedimientos de Patente, y ha recibido el número de depósito 08060601.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, ésta se refiere al uso del anticuerpo monoclonal de la invención en la detección y cuantificación de moléculas de antitrombina citrulinada humana en muestras biológicas aisladas del cuerpo. En dicho procedimiento se utiliza un anticuerpo monoclonal específico que reconoce la antitrombina humana citrulinada aplicado a diferentes métodos de detección (western-blott de geles en condiciones nativas, o ELISA).
Así, la invención proporciona un método para detectar antitrombina citrulinada humana en un fluido corporal o preparación aislado del cuerpo conteniendo dicha antitrombina citrulinada humana, caracterizado porque dicho método comprende:
i) poner en contacto dicho fluido corporal o preparación aislado del cuerpo con el anticuerpo monoclonal de la invención; y
ii) detectar la cantidad de anticuerpo monoclonal unido, la cantidad de anticuerpo monoclonal libre, o ambos.
La determinación de la cantidad de anticuerpo monoclonal unido, la cantidad de anticuerpo monoclonal libre o ambas se puede realizar, de manera preferida, mediante ELISA o western-blott de geles en condiciones nativas.
Según otro aspecto de la presente invención, ésta proporciona el uso del anticuerpo monoclonal de la invención en el diagnóstico y pronóstico de distintas enfermedades en el que esta modificación post-traduccional forma parte del mecanismo patológico. Preferentemente, dicha enfermedad se selecciona entre el grupo formado por una enfermedad hemostásica, trombótica, reumatológica, neurológica e inflamatoria.
Así, según una realización preferida de la presente invención, ésta proporciona el uso del anticuerpo monoclonal de la invención en el diagnóstico y/o pronóstico de una enfermedad que se selecciona entre artritis reumatoide, esclerosis múltiple, alzheimer y psoriasis.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos.
Descripción de las figuras
Figura 1: La figura 1 muestra el wester-blott del gel que separa, en condiciones nativas, la antitrombina normal no modificada (ATn) y antitrombina citrulinada (ATc) empleando el anticuerpo monoclonal anti-antitrombína citrulinada.
Figura 2: Variación de la absorbancia medida a una longitud de onda de 492 nm en muestras biológicas en función de la concentración de antitrombina citrulinada (ng/ml).
Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
Exposicion detallada de modos de realización
Ejemplo 1
Citrulinación in vitro de la antitrombina humana
La antitrombina humana se citrulinó in vitro siguiendo el procedimiento indicado previamente (Pike y col. J Biol Chem. 1997; 272: 19652-5). Brevemente, la antitrombina se incubó con la enzima peptidilarginina deiminasa procedente de músculo esquelético de conejo en una relación 50:1 (antitrombina:PAD) durante 24 horas a 37ºC en 100 mM Tris-HCl, 5 mM CaCl2, pH 7.4. La reacción fue frenada con EDTA 50 mM.
La citrulinación de la antitrombina fue verificada por tres métodos:
Reivindicaciones:
1. Anticuerpo monoclonal, caracterizado porque fija específicamente la antitrombina citrulinada humana.
2. Anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque es formado por el linaje celular de hibridoma 3B6 depositado de acuerdo con el Tratado de Budapest el día 06 de Junio de 2008 en la European Collection of Cell Cultures (ECACC) con el número de depósito 08060601.
3. La línea de hibridoma depositado de acuerdo con el Tratado de Budapest el día 06 de Junio de 2008 en la European Collection of Cell Cultures (ECACC) con el número de depósito 08060601.
4. Uso de un anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque éste se emplea para la detección cualitativa o cuantitativa de la antitrombina citrulinada humana en una muestra biológica aislada del cuerpo.
5. Método de obtención del anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizado porque comprende las etapas:
i) inmunización de ratones con antitrombina citrulinada;
ii) fusionar células del bazo de los ratones con la línea celular de mieloma murino X63;
iii) hacer crecer las células de hibridoma resultantes;
iv) identificación y clonación de los hibridomas secretores de inmunoglobulinas anti-antitrombina citrulinada; y
v) uso de los hibridomas clonados para la producción de los anticuerpos monoclonales de acuerdo con la reivindicación 1.
6. Un método para detectar antitrombina citrulinada humana en un fluido corporal o preparación aislado del cuerpo conteniendo dicha antitrombina citrulinada humana, caracterizado porque dicho método comprende:
i) poner en contacto dicho fluido corporal o preparación aislado del cuerpo con el anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1; y
ii) detectar la cantidad de anticuerpo monoclonal unido, la cantidad de anticuerpo monoclonal libre, o ambos.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque comprende determinar la cantidad de anticuerpo monoclonal unido, la cantidad de anticuerpo monoclonal libre o ambas mediante ELISA o western-blot de geles.
8. Uso del anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1, en el diagnóstico y pronóstico de una enfermedad que se selecciona entre el grupo formado por una enfermedad hemostásica, trombótica, reumatológica, neurológica e inflamatoria.
9. El uso de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque la enfermedad se selecciona entre artritis reumatoide, esclerosis múltiple, alzheimer y psoriasis.
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