AISLAMIENTO DE ACEITES MICROBIANOS.

Un proceso para obtener un aceite a partir de células microbianas que son células de Mortierella alpina,

comprendiendo el aceite ácido araquidónico (ARA), y comprendiendo el proceso: (a) romper las paredes celulares de las células microbianas para liberar el aceite; y (b) separar, por centrifugación, el aceite de al menos parte de los residuos de paredes celulares formados en (a); y en el cual no se emplea disolvente alguno para el aceite en las etapas (a) y (b)

La presente invención se refiere a la extracción (y el aislamiento posterior) de un aceite microbiano (o de células simples) que comprende ácido araquidónico (ARA), a partir de organismos monocelulares (o micro-organismos) que son células de Mortierella alpina. El proceso de la invención implica la disrupción o lisis de las 5 paredes de las células microbianas, seguido por separación del aceite de los residuos celulares resultantes.

Los ácidos grasos poliinsaturados (o PUFAs) se encuentran en la naturaleza y una gran diversidad de diferentes PUFAs son producidos por diferentes organismos monocelulares (algas, hongos, etc). Dichos ácidos tienen muchos usos, por ejemplo inclusión en productos alimenticios (tales como fórmulas para niños), suplementos nutricionales y productos farmacéuticos. 10

En la mayoría de los procesos de producción de PUFA microbianos se cultiva primeramente un microorganismo en un fermentador en un medio adecuado. La biomasa microbiana se cosecha luego y se trata para permitir la extracción subsiguiente de un lípido de la biomasa con un disolvente adecuado. El lípido se somete usualmente a varios pasos de refino. Debe tenerse precaución durante el proceso debido a que puede producirse degradación si los lípidos se someten a lipólisis o condiciones oxidantes, por ejemplo calentamiento (en presencia 15 de oxígeno) y/o debido a lipasas o lipoxigenasas. La técnica expone que a fin de evitar la oxidación (tal como la resultante de la disrupción abierta de las células y exposición subsiguiente del contenido al oxígeno) los PUFAs pueden extraerse de las células totalmente intactas utilizando un disolvente (véase WO-A-97/36996 y WO-A-97/37032). El uso de disolventes es una vía común de eliminación de los lípidos de la biomasa microbiana (WO-A-98/50574). 20

GB-A-808128 describe un método para aumentar el contenido graso de microorganismos que requieren i-inositol para crecimiento normal, tales como Saccharomyces. La extracción de la grasa por medio de un disolvente orgánico (éter de petróleo) se describe en los ejemplos. Una memoria descriptiva provisional menciona extracción con un disolvente o trituración y/o centrifugación.

Rema Vazhappilly et al., JOACS, Vol. 75, no. 3 (1998), páginas 393-397, XP-002152068 describen la 25 investigación de cepas de microalgas en cultivos fotoautótrofos en matraz en cuanto a su potencial de producción de ácido eicosapentaenoico (EPA) y ácido docosahexaenoico (DHA). Los lípidos se extraen por procedimientos modificados de Bligh y Dyer, lo que implica homogeneización con cloroformo/metanol/agua, y separación de la capa de cloroformo con los lípidos.

US-A-5338673 describe un proceso para la producción selectiva de ácidos grasos poliinsaturados a partir de 30 un cultivo de microalgas de Porphyrium cruentum. Se describe un proceso en el cual una suspensión de microalgas se introduce en un homogeneizador-triturador dando como resultado el estallido de las microalgas. Los fragmentos de microalgas se separan del medio tamponado en un decantador o, alternativamente, por centrifugación. La fase sólida, que según se describe contiene la totalidad de los ácidos grasos poliinsaturados, se somete a extracción con disolvente. 35

WO-A-9704121 describe un proceso en el cual se extrae un aceite de microorganismos que contienen aceite y se ponen en contacto los mismos en presencia de un contenido de agua de al menos 70% en peso de la presente originalmente en el material celular con un disolvente del aceite inmiscible con el agua, se separa el disolvente de los microorganismos y se recupera el aceite en el disolvente. La separación del disolvente puede realizarse por centrifugación. Como microorganismo se utiliza Mortierella alpina a fin de producir un aceite que comprende ácido 40 araquidónico (ARA).

Graille et al., Oleagineux, vol. 43, no. 4 (1988), páginas 181-190, XP 008005863 se refiere a la extracción de aceite a partir de semillas o de pulpa de frutos. Se menciona el uso de enzimas para ayudar al proceso de extracción estándar.

US-A-5897994 describe un proceso en el cual una mezcla de ácidos grasos rica en ácidos grasos 45 poliinsaturados se esterifica por catálisis enzimática y a continuación se saponifica la mezcla de reacción, lo cual proporciona una fase orgánica que contiene ésteres y una fase acuosa que contiene ácidos grasos, se separan las fases y los ácidos grasos de la fase acuosa se extraen con un disolvente no polar a fin de obtener los ácidos grasos en el disolvente. La separación entre la fase acuosa y la fase orgánica puede favorecerse por adición de una solución saturada de cloruro de sodio. 50

WO-A-0153512, que es un documento de acuerdo con el art. 54(3) EPC, describe un método para extraer lípidos de microorganismos sin utilizar un disolvente orgánico no polar. El proceso implica lisar las células, y centrifugar la mezcla de células lisadas a fin de obtener una capa pesada y una capa ligera, y obtener el lípido a partir de la capa ligera. El lípido puede comprender un ácido graso poliinsaturado.

Aunque estos procesos de extracción han sido utilizados desde hace varios años, el disolvente precisa ser 55 eliminado y esto da como resultado un coste adicional. Además, si el lípido debe utilizarse en un producto alimenticio, es importante que ciertos disolventes, tales como hexano, se eliminen por completo, o permanezcan

únicamente en cantidades muy pequeñas. Si el hexano se elimina por evaporación, esto puede implicar calentamiento, lo cual no sólo aumenta los costes, sino que puede causar degradación de los lípidos. Adicionalmente, con las preocupaciones ambientales crecientes, el uso de disolventes para la extracción de lípidos se está haciendo crecientemente caro e impopular.

La presente invención trata por tanto de resolver o al menos mitigar estos problemas. La solicitante ha 5 encontrado que los lípidos, tales como los que comprenden un PUFA, pueden ser extraídos eficientemente de las células microbianas sin necesidad de disolventes.

Así pues, de acuerdo con la presente invención se proporciona un proceso para obtención de un aceite a partir de células microbianas que son células de Mortierella alpina, comprendiendo el aceite ácido araquidónico (ARA) y comprendiendo el proceso: 10

(a) romper las paredes celulares de las células microbianas para liberar el aceite; y

(b) separar, por centrifugación, el aceite de al menos parte de los residuos de paredes celulares formados en (a); y

en el cual no se emplea disolvente alguno para el aceite en las etapas (a) y (b). Es posible luego recuperar (c), purificar y/o aislar el aceite (microbiano). Puede alcanzarse un rendimiento satisfactorio del aceite utilizando este 15 proceso sin necesidad de un disolvente.

Procesos de preparación de PUFA recientes recomiendan mantener las células microbianas intactas (WO-A-97/36996). Esta publicación describe un proceso de producción de PUFA en el cual se genera una biomasa microbiana por fermentación de un microorganismo, y después de la fermentación se calientan las células. Se elimina agua de la biomasa, y el material resultante se extrude para formar gránulos porosos. El PUFA se extrae 20 luego de las células intactas en el interior de los gránulos por contacto con un disolvente, usualmente hexano. El hexano se evapora luego para producir un aceite bruto. A todo lo largo de este proceso, las células se mantienen intactas a fin de prevenir que el oxígeno de la atmósfera entre en contacto con los PUFAs dado que se piensa que esto podría causar oxidación indeseable. Sin embargo, se ha encontrado ahora que puede conseguirse una calidad satisfactoria de aceite PUFA si las células se lisan de hecho: cualquier oxidación potencial por la atmósfera puede 25 ser compensada con creces por la ventaja de evitar la necesidad de disolventes.

PUFAs y microorganismos

El ARA puede proporcionarse en la forma de un ácido graso libre, una sal, como un éster de ácido graso (v.g. éster metílico o etílico), como un fosfolípido y/o en forma de un mono-, di- o triglicérido.

La fuente de ARA es Mortierella alpina. 30

En el proceso de la invención, las células microbianas (o microorganismos) pueden cultivarse o fermentarse en primer lugar adecuadamente, por ejemplo en una vasija de fermentación que contenga un medio de cultivo (v.g. acuoso). Las condiciones de fermentación pueden optimizarse para un contenido elevado de aceite... [Seguir leyendo]

1. Un proceso para obtener un aceite a partir de células microbianas que son células de Mortierella alpina, comprendiendo el aceite ácido araquidónico (ARA), y comprendiendo el proceso:

(a) romper las paredes celulares de las células microbianas para liberar el aceite; y

(b) separar, por centrifugación, el aceite de al menos parte de los residuos de paredes celulares formados en (a); y 5

en el cual no se emplea disolvente alguno para el aceite en las etapas (a) y (b).

2. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual las células se rompen física, enzimática o mecánicamente.

3. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 2, en el cual la disrupción comprende homogeneización.

4. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 3, en el cual la disrupción comprende homogeneización a 10 una presión comprendida entre 150 y 900 bar.

5. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende adicionalmente:

(c) extracción, purificación o aislamiento del aceite microbiano, en el cual no se emplea disolvente alguno para el aceite.

6. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual la separación da 15 como resultado la formación de una capa aceitosa y una capa acuosa.

7. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 6, en el cual la capa aceitosa es una capa superior por encima de la capa acuosa.

8. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende, antes de (a), cultivar o fermentar células microbianas en condiciones que permiten la producción del aceite, y en caso necesario 20 pasteurizar y/o calentar las células.

9. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual la disrupción de las paredes celulares se favorece por medio de una o más enzimas degradantes de las paredes celulares o agentes tensioactivos.